氨基吡唑抗利什曼原虫药物靶点LINF_180011100 FYVE锌指结构域的鉴定与作用机制研究

《Nature Communications》：Deconvoluting the mode of action of antileishmanial aminopyrazoles through chemical mutagenesis

　　

摘要

氨基吡唑已成为一类有前景的抗利什曼原虫化合物。分子靶点鉴定一直是一个主要挑战，因为连续的药物暴露未能筛选出耐药性。化学诱变结合氨基吡唑选择压力和全基因组测序被用作一种替代方法。从获得的 28 株耐药品系中，发现 >10-49 倍耐药性与 LINF_180011100 C 端 FYVE 锌指结构域中多个独立的杂合突变之间的关联。LINF_180011100 基因过表达和 CRISPR-Cas9 基因编辑独立证实了这种与 10 至 30 倍氨基吡唑耐药性的关联。与 N 端绿色荧光蛋白标签的基因融合以及与 C 端 mCherry 标记的小 GTPase Rab5 的部分共定位表明，功能蛋白主要定位在内吞囊泡中。原位靶点结合试验证实了氨基吡唑的选择性效应，以及通过引入赋予耐药的突变对其作用的消除。最后，通过生物物理实验证明了先导化合物与重组生产的 LINF_180011100 FYVE 锌指结构域之间的直接相互作用。因此，这项工作正式验证了 LINF_180011100 作为几种氨基吡唑先导化合物的药物靶点和耐药决定因素，并提供了关于作用机制的见解。