XIST驱动人X染色体失活并保障女性胚外细胞存活：基于naive人多能干细胞胚外分化模型的研究

《Nature Communications》：XIST drives X-chromosome inactivation and safeguards female extraembryonic cells in humans

　　

X染色体失活（X-chromosome inactivation，XCI）对小鼠胚外组织生长和胚胎发育至关重要。然而，其发生时机和调控的物种特异性差异使人XCI在人类发育中的作用尚不清楚。研究人员发现，naive人多能干细胞（naive human pluripotent stem cells，hPSCs）向滋养层干细胞（trophoblast stem cells，TSCs）和胚外中胚层细胞（extraembryonic mesoderm cells，EXMCs）的体外分化伴随XCI。失活X染色体（inactive X chromosome，Xi）呈现非典型染色质状态，缺乏DNA甲基化和经典异染色质标志。研究人员证明，胚外分化与XCI在时间上相关联。利用功能缺失方法，研究人员发现XIST是人XCI建立所必需的。此外，研究人员表明，XCI对人女性胚外细胞存活是必需的。总之，这些发现将XCI与人胚外谱系形成联系起来，对人类生殖生物学具有重要意义。

在雌性真兽类哺乳动物中，X染色体失活（X-chromosome inactivation，XCI）沉默两条X染色体中的一条。小鼠中，长非编码RNA Xist触发XCI并招募转录沉默共因子，形成异染色质化的失活X染色体（inactive X chromosome，Xi）；XCI在小鼠早期胚胎和胚外组织中以印迹方式建立，Xist突变导致雌性早期致死，并归因于胚外组织缺陷。与之不同，人XCI的动力学及其对胚外谱系发育的重要性尚不清楚，XIST在人这些过程中的作用此前未被正式检验，尽管其可能影响胚胎植入、妊娠成功及发育源性疾病。人围着床期建立XCI，且不同谱系动力学不同，首先见于滋养外胚层；人胚外发育与小鼠明显不同，人无胚外外胚层，胚外中胚层在原肠形成前指定。naive人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）具有两条活跃X染色体（X^aX^a），可模拟植入前上胚层，并能在体外分化为TSCs和EXMCs，为研究人XCI建立提供了系统。该论文发表于《Nature Communications》，研究人员利用naive hPSCs的体外胚外命运诱导，研究人XCI的机制和意义，结论是XIST驱动人XCI建立并保障女性胚外细胞存活。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员以女性H9 hESCs（WiCell）以及ICSIG-1、SIG-1人诱导多能干细胞（hiPSCs）和WIBR2-MGT hESCs等naive多能干细胞为模型，经体外诱导分化为EXMCs和TSCs；采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）及scLinaX等位分析、RNA荧光原位杂交（RNA FISH）与免疫荧光（IF）/IF-FISH、CUT&RUN/CUT&Tag和ChIP-seq、MeD-seq、三维结构光照明显微镜（3D-SIM）、流式细胞术、bulk RNA-seq，以及多西环素（Dox）诱导的dCas9-KRAB介导XIST敲低（XIST inducible knockdown，XIST iKD）；并重分析已发表的naive hPSCs向EXMCs/TSCs分化的scRNA-seq时间序列数据。

研究结果：

**XCI is established in human extraembryonic cells**：研究人员将女性H9 naive hESCs分化为EXMCs和TSCs，利用scRNA-seq等位分析、bulk RNA-seq、针对HUWE1、ATRX、POLA1和THOC2的RNA FISH、XIST/POLA1双FISH以及Ser5P RNA聚合酶II（Ser5P POL II）与H2AK119ub/H3K27me3免疫荧光检测。结果显示，EXMCs和TSCs中X连锁基因由双等位转为单等位表达，XIST包被的X染色体上POLA1表达受抑，Ser5P POL II从H2AK119ub/H3K27me3富集区排除，提示胚外命运诱导伴随XCI建立。

**Unusual chromatin remodeling accompanies XCI**：通过CUT&RUN检测H3K27me3、H2AK119ub和H3K9me3，结合等位分配、IF、3D-SIM、macroH2A1免疫荧光和MeD-seq，研究人员发现EXMCs和TSCs的Xi染色质状态非典型：H3K27me3和H2AK119ub在X染色体总体富集低于naive hESCs，Xi相对X^a和常染色体无明显富集；但Xi更浓缩，XIST云更紧凑，macroH2A1富集少，DNA甲基化水平低，类似naive hESCs而非primed hESCs。表明人胚外细胞Xi缺乏多数经典XCI异染色质标志。

**XCI is temporally linked with extraembryonic identity**：研究人员在分化第0、4、8、10、12、14、16天进行POLA1和HUWE1 RNA FISH，并结合GATA3、VIM、GATA6免疫荧光及时间序列scRNA-seq等位分析。结果显示，POLA1由双等位向单等位表达的转换主要发生在第4至8天，与GATA3⁺滋养层细胞和VIM⁺EXMCs出现及EXMC/TSC身份获得相吻合，Ser5P POL II排除也在此期间增强。表明XCI建立与胚外身份诱导在时间上紧密关联。

**Loss of XIST impacts human extraembryonic cell survival**：研究人员采用Dox诱导的XIST iKD系统敲低naive H9 hESCs中的XIST，并进行EXMCs/TSCs分化、明场与GATA3免疫荧光、ENPEP流式细胞术、第0/4/8天scRNA-seq、差异表达基因（DEGs）和基因本体（GO）分析及Annexin V流式检测。结果显示，XIST缺失不影响naive状态和早期分化，第8天细胞仍可进入EXMC/TSC身份；但第15天胚外细胞大量丢失，GATA3⁺和ENPEP⁺细胞显著减少。XIST缺失后的DEGs富集于发育、分化、增殖和凋亡调控，凋亡相关基因失调，残余ENPEP⁺细胞Annexin V信号升高。表明XIST缺失损害人女性胚外细胞存活并诱导凋亡。

**XIST is necessary for the establishment of human XCI**：研究人员对XIST iKD细胞进行scRNA-seq伪bulk X染色体与常染色体表达比（X:A ratio）分析、DEG染色体定位、POLA1 RNA FISH和bulk RNA-seq等位分析。结果显示，XIST缺失后X:A表达比升高，第8天差异表达上调基因在X染色体显著富集，且多数属于体细胞中已知的XCI底物基因；POLA1在多数XIST缺失细胞中呈双等位表达，bulk RNA-seq等位比升高，单等位表达受损。表明XIST是人XCI建立所必需的，XIST缺失所致表型与XCI建立受损相关。

讨论部分总结：研究人员指出，小鼠长期是XCI研究的主要模型，但非啮齿类研究提示需重新审视物种特异性X染色体剂量调控；naive hPSCs为解析人XCI建立提供了系统。该研究将XCI与人胚外命运联系起来，揭示从X染色体dampening向XCI转换的灵长类特异生物学。EXMCs和TSCs中Xi经CUT&RUN未显示相对常染色体和X^a的抑制性染色质标志富集，DNA低甲基化与人胎盘X连锁启动子低甲基化报道一致；IF中Xi标志可见可能与组蛋白密度和Xi三维构象有关。最显著结论是XCI支持女性hESC来源胚外细胞存活，XIST缺失细胞虽可退出naive多能性并进入胚外身份，但该状态不能维持并发生细胞死亡；XCI建立与XIST缺失致死之间存在时间差，讨论提出mRNA水平变化与细胞稳态后果延迟、X连锁产物剂量需求或后续X连锁基因失活等非互斥可能。该表型与小鼠胚外外胚层祖细胞发育对XCI的需求平行，尽管人无对应细胞。研究也指出模型、分化条件、naive hPSCs与胚胎XIST云差异、XCI偏斜机制及未分型亲本基因组等限制。

研究结论部分翻译：总之，研究人员的工作揭示了XIST是人XCI建立所必需的，并揭示其在人女性胚外细胞存活中的作用，至少在体外如此。研究提示，女性人发育过程中细微的XCI失调可能通过未能建立胎盘祖细胞程序而促成围着床期胚胎丢失，这一假说仍有待在人胚胎中研究。