基于单细胞转录组学解析SLC40A1+小胶质细胞介导炎症反应在糖尿病视网膜病变中的作用

《ASN Neuro》：Employing the Role of SLC40A1-Mediated Microglia Inflammatory Response in Diabetic Retinopathy Based on Single-Cell Transcriptomics Technology

　　

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病最严重的并发症之一。现有治疗有效，但仍存在许多局限。因此，揭示新的治疗靶点并开发更有效的治疗策略尤为关键。本研究从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取DR患者视网膜及正常视网膜组织的单细胞数据集。通过细胞注释、基因本体（Gene Ontology, GO）通路富集分析和细胞轨迹分析，筛选影响DR进展的关键细胞亚群及其富集通路。构建DR模型小鼠。采用免疫荧光（immunofluorescence, IF）检测评估SLC40A1与小胶质细胞标志物IBA1的共定位。采用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）、Western Blot和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）评估炎症因子表达水平。生物信息学分析显示，在DR患者视网膜组织中，SLC40A1⁺小胶质细胞异常积聚，并与炎症通路紧密相关。动物实验显示，DR模型小鼠中SLC40A1与IBA1的共定位水平升高。进一步研究表明，敲除小胶质细胞中的SLC40A1基因可降低促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平，并有效缓解DR的病理特征。SLC40A1⁺小胶质细胞通过调控炎症反应控制DR进展，为DR治疗中的新治疗靶点提供了有前景的途径。

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病常见微血管并发症，病理特征包括毛细血管变性、周细胞丢失和血管渗漏；现有全身治疗、玻璃体切割、视网膜光凝和玻璃体内抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）抑制剂治疗主要针对晚期DR，对早期病变效果有限，且可能带来周边视野永久性丧失和黄斑水肿加重等不良反应，因此发现新靶点和更有效策略十分迫切。视网膜小胶质细胞（microglia, MG）是视网膜固有免疫细胞，高糖和氧化应激可促使其反应性活化并分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，破坏血-视网膜屏障（blood-retinal barrier, BRB）并损伤神经血管单元；单细胞转录组学提示DR中MG存在功能不同的亚群，其活化格局较既往认识更复杂。SLC40A1又称FPN1、MTP1或IREG1，是维持铁稳态的关键铁转运体，受缺氧、铁水平和炎症信号调控，并通过铁死亡通路参与糖尿病进展、椎间盘退变和极化心肌损伤等疾病，但其在DR中的生物学功能和调控机制尚未阐明。为此，研究人员分析正常视网膜与DR患者视网膜单细胞测序数据，发现SLC40A1⁺MG在DR视网膜中显著上调，并通过动物模型揭示该亚群通过影响炎症促进DR进展的生物学功能。该研究加深了对DR发病机制的理解，并为开发靶向治疗策略提供了新的潜在靶点。

关键技术方法概括（约250字内）：研究人员从GEO数据库获取GSE165784、GSE245561（DR视网膜，分别含5例和4例DR视网膜标本）及GSE202735（健康人视网膜）单细胞转录组数据；采用Seurat进行质控、归一化、主成分分析（principal component analysis, PCA）、统一流形近似与投影（uniform manifold approximation and projection, UMAP）、无监督聚类和细胞注释，并以Harmony整合MG后进行亚聚类；用FindMarkers筛选差异表达基因，行GO和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，并用Monocle2进行拟时序轨迹分析。动物实验采用db/db糖尿病小鼠（购自GemPharmatech LLC.）及Cx3cr1-CreERT2介导的小胶质细胞特异性SLC40A1条件敲除小鼠（由Shanghai Model Organisms Center, Inc.提供），在db/db背景建立db/db-NC与db/db-SLC40A1^?/?组（每组n=8），25周终点取材；采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色、IF、qPCR、Western Blot和ELISA检测，并进行统计学分析。

研究结果如下。（1）单细胞转录组分析：研究人员对各数据集分别完成质控、归一化、降维、无监督聚类和细胞类型注释，UMAP显示GSE165784、GSE245561和GSE202735分别得到16、26和22个细胞簇，并根据经典标志基因注释内皮细胞、成纤维细胞、MG、单核细胞、浆细胞、T细胞及正常视网膜中的视杆细胞、黑素细胞和中性粒细胞等；气泡图显示CLDN5、VWF、CDH5富集于内皮细胞，COL1A1、COL1A2、COL3A1、DCN富集于成纤维细胞，C1QA、C1QC、APOE、ITGAM高表达于MG，TRAT1、CD3D、CD3E、IL7R富集于T细胞，验证了注释可靠性；结论是研究构建了健康和DR视网膜主要细胞亚群的单细胞图谱，为后续MG亚群研究奠定基础。（2）小胶质细胞在DR进展中的调控：提取MG整合再聚类后分为APOC1⁺ MGC、MKI67⁺ MGC、NAMPT⁺MGC和SLC40A1⁺ MGC四个功能亚群；APOC1⁺ MGC以APOC1、HMOX1、MARCO和GAPDH升高为特征，MKI67⁺ MGC高表达MKI67和TOP2A，NAMPT⁺MGC以NAMPT、ATP1B3、DOCK4和ZNF331为标志，SLC40A1⁺ MGC显著上调SLC40A1、IFI27和IGSF6；DR样本中SLC40A1⁺ MGC比例高于正常样本，而NAMPT⁺MGC在正常样本中更丰富，差异表达分析证实SLC40A1⁺ MGC中SLC40A1及免疫活化标志IFI27、IGSF6升高；结论是DR视网膜MG组成发生重塑，SLC40A1⁺ MGC为疾病特异性活化亚群，可能驱动局部炎症级联。（3）小胶质细胞轨迹分析：对SLC40A1⁺ MGC特异上调基因行KEGG和GO分析，KEGG富集于吞噬体、抗原加工与提呈、氧化磷酸化、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化及细胞黏附分子；GO生物学过程富集于抗原加工与提呈、MHC II类分子介导的肽抗原提呈及外源性肽抗原提呈，分子功能富集于MHC II类蛋白复合物结合、MHC蛋白复合物结合、MHC II类受体活性、免疫受体活性和肽抗原结合，细胞组分富集于MHC II类蛋白复合物、MHC蛋白复合物、液泡膜、溶酶体膜和囊泡腔；Monocle2拟时序分析将MG分为三个轨迹分支，NAMPT⁺MGC主要位于早期伪时间阶段，SLC40A1⁺ MGC积累于晚期轨迹并与APOC1⁺ MGC部分重叠，SLC40A1、IFI27和IGSF6随伪时间推进逐渐上调；结论是SLC40A1⁺ MGC具有较强抗原提呈和免疫应答能力，并随DR演进逐步积累。（4）DR模型小鼠视网膜组织中SLC40A1高表达：与对照小鼠相比，DR模型小鼠视网膜出现明显微血管异常和出血，H&E显示视网膜厚度显著增加，IF显示SLC40A1与MG标志物IBA1共定位增加，高倍图像显示IBA1阳性信号主要位于DAPI染色核周胞质区，而SLC40A1在同一细胞中呈更外周、膜相关分布；qPCR和Western Blot显示视网膜组织中SLC40A1及炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达上调；结论是SLC40A1⁺MG可能通过调控炎症反应参与DR进展。（5）SLC40A1⁺MG介导炎症反应促进DR进展：研究人员在db/db糖尿病背景构建小胶质细胞特异性SLC40A1条件敲除小鼠，并以qRT-PCR验证敲除效率，比较db/db-NC与db/db-SLC40A1^?/?组发现，SLC40A1^?/?组视网膜损伤严重程度减轻、视网膜厚度降低，高倍图像仍可见IBA1和SLC40A1信号位于同一DAPI阳性细胞内并保持不同胞质和外周分布模式；ELISA和Western Blot显示SLC40A1^?/?小鼠视网膜和血浆中IL-6、TNF-α和IL-1β表达显著下调；结论是降低MG中SLC40A1表达可延缓DR病理进展，SLC40A1⁺MG可能通过介导炎症反应促进DR相关视网膜炎症和病理改变。

讨论部分总结：研究人员认为，DR中促炎性MG活化主要由SLC40A1⁺这一离散亚群驱动，SLC40A1可作为追踪该致病亚群的分子标志。SLC40A1编码铁转蛋白（ferroportin），是主要铁外排转运体，其转录水平影响细胞内铁稳态、活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成和炎症信号；铁稳态与炎症级联之间存在自我放大的正反馈环路，促炎刺激下核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信号轴可招募组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3至SLC40A1启动子，抑制其转录并导致髓系细胞内铁潴留，铁超载进一步促进ROS产生并过度激活NF-κB、增加IL-6等促炎介质分泌。该调控环路与本研究中SLC40A1⁺MG在DR视网膜选择性扩增、免疫活化和炎症相关通路富集、db/db小鼠中SLC40A1与IBA1共定位增强，以及MG限制性SLC40A1敲除后IL-6、TNF-α、IL-1β下降和视网膜炎症浸润及组织损伤减轻的结果相一致；原文指出铁稳态-炎症正反馈轴在糖尿病视网膜SLC40A1⁺MG中持续激活的机制假设仍需进一步实验验证。讨论同时指出，SLC40A1上调究竟是炎症级联的因果驱动因素还是活化MG的表型生物标志尚未解决，另一种解释是SLC40A1升高部分反映高糖、氧化应激或组织损伤触发的MG活化状态，而非上游炎症启动因子；视网膜MG可通过P2X7R等危险感知受体直接分泌成熟IL-1β，DR中IL-1β、IL-6和TNF-α受多条上游信号分支调控，SLC40A1是其中铁代谢相关调控节点之一，后续需在原代或分选视网膜MG中追踪铁稳态、氧化应激和炎症信号变化以明确其功能。局限性包括：功能验证仅在小鼠模型完成，未用临床人视网膜标本验证；MG鉴定仅依赖IBA1，而IBA1也表达于浸润外周巨噬细胞和其他髓系群体，不能仅凭单一标志完全区分 resident视网膜MG与骨髓来源髓系细胞，后续需结合TMEM119、P2RY12、CD45、CD11b及流式细胞术或多重IF；受实验条件限制未行视网膜胰蛋白酶消化实验，无法直接定量评估无细胞毛细血管形成和周细胞丢失等DR微血管退行性表型，需进一步结合视网膜胰蛋白酶消化、血管形态定量和临床样本验证。研究结论（译）：SLC40A1⁺小胶质细胞通过调控炎症反应控制DR进展，为DR治疗中的新治疗靶点提供了有前景的途径。