USF2缺失通过异体自噬和LC3相关吞噬作用促进鼠伤寒沙门菌的胞内清除

《Animal Cells and Systems》：USF2 deficiency enhances intracellular clearance of Salmonella Typhimurium via xenophagy and LC3-associated phagocytosis

　　

上游刺激因子2（USF2）是一种转录因子，已知作为转录激活因子结合基因启动子中的E-box基序。近期，研究人员报道USF2也是编码溶酶体和自噬（autophagy）机器基因的转录抑制因子，其缺失导致自噬升高。本研究旨在确定USF2缺失是否使宿主细胞更有效地抵御细菌感染并限制胞内细菌生长。在此背景下，研究人员采用鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. Typhimurium）作为模型病原体，监测野生型（WT）细胞和USF2缺陷细胞在感染时程中胞内细菌负荷的变化。感染后WT细胞中胞内细菌数增加，但在USF2缺陷细胞中保持相似或减少。该现象在多种细胞类型中观察到，包括小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）、RAW264.7巨噬细胞样细胞和原代骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）。WT和USF2缺陷巨噬细胞的吞噬水平相同，但后者具有更高的基础自噬、增加的溶酶体丰度和增加的溶酶体基因表达。此外，LC3相关吞噬作用（LC3-associated phagocytosis，LAP）组分，如LC3B和RUBICON，以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，在USF2缺陷巨噬细胞中升高。研究人员的结果表明，非吞噬细胞中增强的自噬和吞噬细胞中升高的自噬与LAP均有助于USF2缺陷细胞改善胞内病原体清除。

研究背景与意义：自噬（autophagy）是维持细胞稳态的降解过程，功能异常与多种人类疾病相关；当自噬特异性靶向胞内病原体时称为异体自噬（xenophagy）。鼠伤寒沙门菌（S. Typhimurium）可侵入巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞等吞噬及非吞噬细胞，在沙门菌含菌空泡（Salmonella-containing vacuole，SCV）内存活繁殖；逃逸至胞质后，细菌被宿主泛素化并由p62、optineurin（OPTN）等异体自噬受体识别，经自噬体隔离并最终在自噬溶酶体降解。LC3相关吞噬作用（LAP）是巨噬细胞等专业吞噬细胞利用自噬系统的防御方式，LC3整合到单膜吞噬体（LAPosome）而非典型双膜自噬体；LAP依赖RUBICON和活性氧（ROS）产生，RUBICON使磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）结合LAPosome并激活NADPH氧化酶2（NOX2），后者为ROS产生和LC3脂化所需；LAP亦参与抗S. Typhimurium感染。USF1和USF2属碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（bHLH-LZ）家族转录因子，调节免疫反应、糖脂代谢、细胞增殖、昼夜节律和发育；主要结合E-box基序作为转录激活因子，但在多种细胞和生理条件下也有转录抑制效应。近期研究表明USF2可招募核小体重塑与去乙酰化酶（NuRD）复合物，其中组蛋白去乙酰化酶（HDACs）去除组蛋白乙酰基，导致染色质凝聚和转录沉默；USF2抑制自噬和溶酶体基因，其缺失使LC3-II和ATG5升高并增强自噬。基于此，研究人员以S. Typhimurium为模型，检验USF2缺失是否增强宿主细胞对细菌感染和胞内细菌生长的保护。意义在于连接自噬-溶酶体轴的转录编程与抗菌活性，并提示靶向USF2可能增强先天免疫。

关键技术方法：研究人员用CRISPR-Cas9构建Usf2 KO小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和RAW264.7巨噬细胞样细胞；将Usf2^flox/flox小鼠（由大阪大学Professor Masahito Ikawa提供）与LysM-Cre转基因小鼠（Jackson Laboratory）杂交，获得髓系特异性Usf2^Δ/Δ小鼠及骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）；以S. Typhimurium ATCC 14028及GFP表达株建立感染模型，采用菌落形成单位（CFU）计数、IncuCyte活细胞成像、共聚焦显微镜、免疫印迹、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、流式细胞术、LysoTracker、DQ-BSA、吞噬实验和ROS检测分析。

研究结果：（1）Usf2缺陷细胞中胞内细菌负荷降低：WT与Usf2 KO MEFs感染后CFU计数显示2 hpi初始入侵相似，8 hpi WT CFUs增近3倍而KO较2 hpi下降；GFP-S. Typhimurium共聚焦及定量显示KO细胞GFP强度较低或随时间下降；LysoTracker显示KO溶酶体面积和强度更高，细菌与溶酶体共定位增加。结论：USF2缺失不影响初始入侵，但限制细菌存活/复制并增强溶酶体靶向。（2）Usf2缺陷BMDMs中自噬和细菌清除增强：因全身性Usf2 KO小鼠胚胎或围产期致死，研究人员构建髓系特异性Usf2^Δ/Δ小鼠；葡萄糖饥饿下Usf2^Δ/Δ BMDMs的LC3B-I向LC3B-II转化和LC3B斑点增加；感染GFP-S. Typhimurium早期GFP阳性比例相似，后期WT增加而Δ/Δ下降；按每细胞1–5、5–20、>20细菌分组，WT含>20细菌比例较高，Usf2缺陷细胞含<20细菌为主。结论：基础和刺激诱导自噬升高，显著抑制S. Typhimurium增殖。（3）Usf2缺陷巨噬细胞中溶酶体活化增强：LysoTracker和DQ-BSA显示Usf2缺陷BMDMs及RAW264.7溶酶体丰度和蛋白水解活性增加；免疫印迹显示LC3B-I向II转化、LAMP1、LAMP2、Cathepsin B、Cathepsin D和GBA升高；qRT-PCR显示GBA、CTSB、LAMP1 mRNA在未感染及感染后更高。结论：蛋白水解活性溶酶体区室扩张。（4）增强的LAP促进Usf2缺陷巨噬细胞的细菌清除：IgG包被乳胶珠吞噬实验显示WT与Usf2缺陷巨噬细胞吞噬量相同；S. Typhimurium感染诱导RUBICON时间依赖性增加，Usf2缺陷RAW264.7和BMDMs更高；DCFDA流式显示感染增加ROS，Usf2^Δ/Δ BMDMs更明显；感染后Usf2缺陷BMDMs的LC3B mRNA更高。结论：LAP增强并促进细菌清除。

讨论总结：研究人员将结果置于异体自噬背景；TFEB（transcription factor EB）作为自噬和溶酶体生物发生主转录激活因子，在沙门菌感染中的作用呈情境依赖：沙门菌脂多糖可诱导结肠上皮细胞TFEB表达和核转位并增强异体自噬，acacetin激活TFEB可增强异体自噬并降低胞内沙门菌负荷；但巨噬细胞感染时TFEB表达下降，差异部分可由细菌生长阶段解释，静止期沙门菌主动抑制TFEB激活，晚对数期允许TFEB激活。USF2缺失表型类似TFEB激活，表现为更有效限制胞内沙门菌复制及自噬/溶酶体基因表达增加。并非所有自噬-溶酶体基因转录抑制因子的缺失都产生同样抗菌优势：表观遗传抑制因子BRD4（bromodomain-containing protein 4）缺失可因自噬流和溶酶体生物发生增强而改善胞内蛋白聚集体清除，但不影响胞内沙门菌复制，提示去抑制自噬-溶酶体基因对异体自噬的效应具有靶基因特异性。Usf2缺陷巨噬细胞对胞内细菌的清除还得到LAP激活支持；LAP是专业吞噬细胞中细胞类型特异性过程，Usf2缺失去抑制溶酶体基因表达，扩张细胞降解能力并增强LAP依赖的吞噬体成熟。研究结论翻译：总之，本研究建立了自噬-溶酶体轴转录编程与抗菌活性之间的联系，并提供USF2缺失增强细胞抗细菌感染抵抗的机制见解。因此，靶向USF2可能是增强先天免疫和加强宿主对持续性胞内感染防御的潜在策略。