檀香醇通过升高ROS水平抑制结直肠癌细胞肺转移的研究

《Antioxidants》：Santalol Suppresses Lung Metastasis of Colorectal Cancer Cells by Increasing ROS Levels

　　

檀香醇（Santalol, STL）是从檀香油中提取的一种倍半萜醇类化合物，已被报道具有抗氧化、抗炎和抗癌作用。然而，该化合物对结直肠癌（colorectal cancer, CRC）细胞肺转移的影响尚未得到充分阐明。在本研究中，研究人员探讨了STL在转移性CRC细胞中的抗癌活性。STL以剂量依赖性方式显著降低细胞活力和克隆形成能力。该化合物通过调控caspase和PARP诱导CRC细胞发生线粒体介导的凋亡。此外，STL降低了总抗氧化能力并增加了活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。这些结果表明，STL可增强线粒体去极化并激活线粒体凋亡途径。利用体内小鼠模型，研究人员进一步证明STL限制了CRC细胞的肺部播散。综上所述，这些发现揭示STL通过诱导由细胞内ROS蓄积驱动的凋亡和线粒体功能障碍，从而阻碍CRC细胞的肺转移。本研究结果支持STL作为转移性CRC的一种有前景的治疗候选药物。

一、研究背景与科学问题

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球发病率与死亡率极高的恶性肿瘤，2022年数据显示其在男性中位居第二、女性中位居第三常见癌症，同时也是仅次于肺癌的第二大癌症死亡原因。约20%–25%的CRC患者在初次诊断时已处于IV期（转移性）疾病阶段，而I–III期患者在接受原发肿瘤切除术后仍有10%–25%发生远处转移。CRC转移主要发生于肝脏和肺部，一旦扩散至远端器官，患者5年生存率骤降至仅14%。传统化疗药物如5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）和奥沙利铂虽有一定疗效，但伴随多种不良反应。因此，开发针对转移性CRC的新型治疗策略迫在眉睫。

凋亡是维持组织稳态、清除受损或潜在恶性细胞的关键调节机制，主要通过外源性死亡受体途径和内源性线粒体途径执行。内源性途径主要由线粒体介导，受细胞内应激源如DNA损伤或过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）激活。与正常细胞相比，癌细胞代谢活跃且促肿瘤信号激活，导致基础ROS水平较高。尽管适度ROS可支持肿瘤进展，但这种固有的氧化应激状态使癌细胞对超过其抗氧化能力的进一步ROS蓄积高度敏感。过量ROS可引起不可逆的氧化损伤，增加线粒体膜通透性，释放细胞色素c等凋亡因子进入胞质，最终激活caspase级联反应诱导癌细胞凋亡。利用这一脆弱性有望实现选择性杀伤癌细胞同时最小化对正常细胞的毒性。

檀香木（Santalum album L.）是一种知名药用植物，其干燥心材传统上用于理气止痛、和胃止呕。檀香醇（santalol, STL）是檀香属植物的主要活性成分，占檀香油的70%–90%，主要由α-和β-异构体组成。作为一种主要的生物活性倍半萜醇，STL在前列腺癌、乳腺癌和皮肤癌等多种癌症中展现出强效抗肿瘤活性，可通过触发内源性凋亡、引起细胞周期阻滞和抑制细胞运动发挥作用。鉴于CRC转移深受氧化应激扰动和异常存活激酶级联驱动，研究人员假设STL可能破坏CRC存活和转移定植。然而，STL在CRC转移中的治疗效用及其分子机制尚待探索。

二、研究方法概述

本研究采用的主要关键技术方法包括：①CCK-8细胞活力测定法计算半数抑制浓度（IC₅₀）；②集落形成实验评估克隆形成能力；③流式细胞术结合Annexin V染色检测凋亡，使用Muse^? MitoPotential试剂盒评估线粒体膜电位变化；④Western blot分析检测凋亡相关蛋白及PI3K/AKT、AMPK、MAPK信号通路蛋白磷酸化水平；⑤Muse^? Oxidative Stress试剂盒测量细胞内ROS水平，EZ-Total Antioxidant Capacity试剂盒测定总抗氧化能力（total antioxidant capacity, TAC），MitoSOX^TM Red线粒体超氧化物指示剂检测线粒体超氧化物生成；⑥体内实验采用雌性BALB/c小鼠经尾静脉注射CT26细胞建立肺转移模型，随机分为5组（每组6只），分别给予口服STL（12.5、25、50 mg/kg，每日一次，共14天）或腹腔注射5-FU（10 mg/kg，每3天一次），收集肺组织和血清进行后续分析。

三、研究结果

3.1 STL抑制CRC细胞增殖和克隆形成潜能

在CT26和HCT116细胞中，STL以浓度依赖方式降低细胞活力，10 μM及以上浓度效果显著。STL在CT26和HCT116细胞中的IC₅₀分别为16.96 μM和18.06 μM。集落形成实验显示STL处理以浓度依赖方式减少集落形成。在正常结肠成纤维细胞CCD-18Co和肥大细胞RBL-2H3中，10 μM STL处理后细胞活力维持在80%以上，20 μM时仍保持高于70%的活力，表明STL对CRC细胞具有选择性细胞毒作用。

3.2 STL诱导CRC细胞发生caspase介导的凋亡

流式细胞术Annexin V检测显示，STL在大于10 μM浓度下显著诱导CT26和HCT116细胞发生浓度依赖性凋亡。Western blot结果表明STL处理促进了caspase-3、caspase-9和PARP的裂解活化，证实STL通过caspase依赖性凋亡途径促进细胞死亡。

3.3 STL诱导的凋亡由CRC细胞线粒体膜电位丧失介导

STL处理24小时后，两种CRC细胞中线粒体去极化比例显著增加。Western blot分析显示STL上调p53表达，促进细胞色素c向胞质释放，同时显著增加促凋亡蛋白Bax的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达。这些结果表明STL通过改变线粒体膜电位，经由内源性途径诱导CRC细胞凋亡。

3.4 STL增加线粒体来源的ROS产生

流式细胞术检测显示STL处理显著提高ROS阳性CRC细胞百分比。总抗氧化能力（TAC）随STL浓度升高呈浓度依赖性下降。MitoSOX荧光染色证实10 μM及以上浓度的STL显著增加线粒体超氧化物生成。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）预处理有效逆转了STL诱导的细胞毒性，证实STL通过诱导过量ROS产生促进CRC细胞凋亡。

3.5 STL调控CRC细胞中PI3K/AKT、AMPK和MAPK信号通路

短期STL处理（10–30分钟）以浓度依赖方式增加PI3K、AKT和AMPK的磷酸化水平。同时，STL显著增强了JNK、p38和ERK的磷酸化。AMPK抑制剂Compound C预处理显著提高了STL处理后的细胞活力，表明STL对CRC细胞的细胞毒效应由AMPK介导。

3.6 STL在小鼠模型中通过诱导凋亡减少CRC细胞肺转移

在尾静脉注射CT26细胞建立的肺转移模型中，口服STL给药2周后以剂量依赖方式减少肺转移结节数量：25 mg/kg和50 mg/kg STL分别将结节数降至对照组的约55%和30%。实验期间各组小鼠体重无显著变化，血清肝肾功能标志物（AST、ALT、肌酐、血尿素氮）未见明显改变。肺组织Western blot分析显示STL处理增加了caspase-3、caspase-9和PARP的裂解，与体外实验结果一致。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次系统阐明了STL在CRC治疗中的潜力，其机制是通过诱导过量ROS生成及后续凋亡来实现。STL通过调节Bcl-2、Bcl-xL和Bax的表达，促进细胞色素c释放，进而激活caspase-9/3途径和PARP裂解。ROS蓄积破坏了线粒体膜电位，促使促凋亡分子从线粒体转位至胞质。此外，STL同时激活PI3K/AKT、AMPK和MAPK（包括JNK、p38和ERK）信号通路，其中AMPK的激活被证实是STL发挥细胞毒效应的关键介导因素。体内实验中，口服STL（12.5–50 mg/kg，持续2周）未引起明显的肝肾毒性，表明该剂量范围安全可行。研究也指出，未来需利用原位模型和全面的药代动力学特征进一步验证这些发现在更广泛临床前和临床环境中的普适性。

研究结论：本研究发现STL抑制CRC细胞的增殖和转移潜能。这一效应源于STL诱导的氧化应激，表现为细胞内总抗氧化能力降低和ROS生成增加。该过程与线粒体介导的凋亡以及PI3K/AKT、AMPK和MAPK信号通路的激活相关联。这些发现将STL确定为开发新型CRC疗法的有前景的候选药物。