《Pharmaceutics》：Advanced Nucleic Acid Architectures: Classification, Assembly Mechanisms, and Biomedical Applications
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中文翻译（摘要）
核酸正日益被开发为用于纳米医学、生物传感和生物材料工程的可编程分子材料，但其生物医学应用仍受限于核酸酶降解、跨膜运输效率低下、内涵体滞留、快速清除以及潜在的免疫激活等问题。本综述提出了一种基于核酸在最终结构中所发挥作用的角色导向框架，对高级核
中文翻译（摘要）
核酸正日益被开发为用于纳米医学、生物传感和生物材料工程的可编程分子材料，但其生物医学应用仍受限于核酸酶降解、跨膜运输效率低下、内涵体滞留、快速清除以及潜在的免疫激活等问题。本综述提出了一种基于核酸在最终结构中所发挥作用的角色导向框架，对高级核酸架构进行分类，涵盖核酸主导型架构（nucleic acid-dictated architectures）、超分子核酸共组装体（supramolecular nucleic acid co-assemblies）以及核酸负载复合生物材料（nucleic acid-loaded composite biomaterials），其中后者包括序列定义的遗传性载荷（sequence-defined genetic cargos）和非序列定义的基于多聚脱氧核糖核苷酸（polydeoxyribonucleotide，PDRN）的再生系统。研究人员比较了序列导向杂交、静电凝聚、金属-配体配位、多胺及多酚介导的相互作用，以及载体或基质限域组装等机制，并将这些机制与结构稳定性、核酸酶抗性、细胞转运、胞内释放、刺激响应性及生物活性相关联。本综述对上述架构在药物与核酸递送、分子诊断、再生及皮肤修复生物材料、疫苗接种和免疫调节中的应用进行了批判性评估。跨平台而言，架构作为一个制剂变量，必须在分子保护与功能性释放、有效递送、生物安全性和可制造性之间取得平衡。转化开发需要建立定量结构-性能关系、标准化表征方法、稳定性评估、可规模化生产工艺，以及情境特异性的药代动力学和监管评价。这一综合视角为高级核酸系统的理性药学开发提供了设计原则。
论文主体内容总结
1. 引言
核酸作为一类重要的生物大分子，不仅参与遗传表达调控和蛋白质合成，还支撑多种细胞生理活动。DNA的双螺旋结构通过碱基配对和碱基堆积实现遗传信息的稳定存储与复制，而各类RNA在蛋白质合成中分别承担信息模板、适配分子和结构-催化核心等角色。核酸分子具有规则的带负电荷的糖-磷酸骨架，以及序列依赖的氢键和堆积相互作用，这使其成为结构可预测、化学可寻址的高级生物材料设计模块。除经典DNA和RNA外，来源于鲑鱼精子等纯化原料的PDRN（分子量约50–1500 kDa，纯度超过95%）因其再生医学和皮肤修复潜力而受到关注，其生物活性主要通过激活腺苷A2A受体和提供核苷酸前体来实现，且其活性被认为是序列非依赖性的。与此同时，核酸从遗传分子向可编程纳米材料的转变推动了结构DNA纳米技术的发展，代表性体系包括DNA折纸、框架核酸、球形核酸和DNA水凝胶等。尽管核酸具有显著的可编程性，但其在生物医学转化中仍面临核酸酶降解、膜通透性差、内涵体滞留、快速清除和免疫刺激等固有障碍。现有综述多按材料组成、结构形态或生物医学应用进行分类，缺乏对核酸在组装过程中功能角色的系统分析。为此，本综述提出基于核酸结构主导作用的分类框架，以回答核酸是作为主要结构蓝图、与外部组分协同构建超分子结构，还是作为载体主导体系中的功能性载荷这一核心问题。
2. 核酸高级架构的结构类别
2.1 核酸主导型架构
2.1.1 球形核酸
球形核酸通过核酸链在纳米尺度基底上的密集有序排列形成球形结构。部分球形核酸制剂相比游离寡核苷酸表现出更强的核酸酶抗性和细胞摄取能力，其摄取依赖于核心组成、寡核苷酸密度、表面化学和细胞类型，支持架构依赖性内吞摄取而非被动膜屏障穿越。功能性递送还需适当的胞内运输和载荷释放。
2.1.2 DNA折纸纳米结构
DNA折纸技术通过长单链M13 DNA支架与约210条短订书钉链的杂交，可构建具有可编程二维、三维或中空几何形状的纳米结构。例如，通过24根精确排列的DNA双螺旋组装四个四分之一环单体，可构建内径约120 nm的DNA折纸环。DNA折纸还可与固态纳米孔集成或工程化为跨膜通道，实现纳米级精度的分子转运和单分子离子电流传感。DNA折纸在应用环境中的行为受静电相互作用、水合效应和机械适应性的复杂调控，应被视为动态聚电解质系统而非刚性纳米框架。其结构稳定性高度依赖离子组成、溶剂条件和外部物理约束。分子动力学模拟和粗粒化模型（如oxDNA）可用于定量分析其平衡结构、热波动、弯曲刚度和构象转变。
2.1.3 框架核酸
以四面体框架核酸架构为代表，通过四条DNA链的序列特异性Watson-Crick碱基配对组装成三维框架。tFNA的标称几何形状由四面体基序定义，但粒径是制剂依赖性属性而非架构固有常数。tFNA可通过小窝蛋白依赖性内吞途径进入细胞，无需额外转染试剂，相比线性核酸表现出改善的结构稳定性和细胞摄取。在部分临床前模型中，tFNA制剂表现出低细胞毒性和有限的免疫激活。以汉黄芩素负载的tFNA复合体系为例，载荷加载使水动力尺寸从约7 nm增至约20 nm，说明功能化可改变载体的理化属性。tFNA的转化开发需控制链化学计量、组装产率、生物体液中的结构完整性、药代动力学和途径依赖性生物分布等参数。
2.1.4 DNA水凝胶
DNA水凝胶通过DNA分子的自组装或交联机制形成三维网络。其设计基于DNA的Watson-Crick特异性分子识别能力，可实现聚合物空间组织的精确调控。DNA水凝胶分为两类：一类整合合成聚合物链，核酸序列主要作为结构交联剂；另一类完全由DNA分子组成，通过编程分子相互作用自组装成水凝胶基质。其可精确调控的理化性质使其在再生医学、受控治疗递送和先进生物医学仪器中具有多样化应用。
3. 超分子核酸共组装机制
高级核酸架构的形成由非共价相互作用主导，主要包括静电吸引、氢键和碱基堆积。带负电的磷酸二酯骨架促进与阳离子物种的结合，实现电荷中和、分子凝聚和超分子组装。
3.1 静电复合
DNA和RNA作为聚阴离子大分子，与多价阳离子、多胺、阳离子聚合物或阳离子脂质结合后可发生链塌缩，形成致密的球状、球形或环状组装体。凝聚体的形态和胶体稳定性受核酸长度和构象刚性、阳离子价态和电荷密度、阳离子与磷酸基团比例、离子强度及混合顺序等因素控制。静电凝聚可减小核酸有效尺寸并增强核酸酶保护和细胞摄取，但过强的复合可能阻碍胞内释放，需在凝聚稳定性和载荷可及性之间取得平衡。
3.1.1 壳聚糖
壳聚糖通过质子化伯胺与阴离子磷酸基团的静电结合形成核酸聚复合物。其分子量、脱乙酰度、质子化程度和N/P比共同决定颗粒尺寸、表面电荷、胶体稳定性和核酸结合能力。以壳聚糖-PDRN纳米颗粒为例，在弱酸性条件下壳聚糖的–NH??基团与PDRN的磷酸基团结合，驱动大分子链塌缩形成约161 nm的球形纳米颗粒，并保护PDRN免受DNase I降解。其pH响应性源于壳聚糖的可逆质子化。对于皮肤导向的壳聚糖-核酸制剂，更相关的设计终点是受控皮肤沉积、局部滞留、核酸酶保护和载荷释放。
3.1.2 聚乙烯亚胺
PEI的分子量和支化度、N/P比及离子环境决定聚复合物的压缩和稳定性。AFM单分子力谱研究表明，PEI主要通过静电相互作用与DNA磷酸二酯骨架结合，而非沟槽结合或嵌入。N/P比增加增强DNA压缩，而相互作用强度在pH 5.0–7.4之间相对稳定，但随离子强度增加而降低。PEI介导的递送具有强制剂依赖性，经典质子海绵假说仍属假设性解释，膜失稳和聚合物溶胀也可能参与内涵体逃逸。
3.1.3 4-二甲氨基吡啶
通过酶促DNA微海绵作为核心模板，利用亲核试剂DMAP与DNA的静电结合逐步松散微海绵内的缠结结构，使DNA重新组装为中空壳状结构，全程在水相中进行，无需有机溶剂和温度控制的变性复性步骤。
3.1.4 多胺介导的核酸静电压缩
天然多胺（亚精胺和精胺）在生理条件下高度质子化，作为多价抗衡离子与核酸磷酸骨架作用。拉曼差谱研究表明，多胺主要扰动磷酸盐相关谱带，核酸碱基敏感标记变化较弱，证实磷酸骨架是主要结合界面，其机制为序列非依赖性的静电屏蔽和链间接近诱导凝聚。多胺价态和分子架构、多胺与磷酸比例、离子强度及单价抗衡离子竞争共同控制压缩程度和形态。
3.2 金属-配体配位
金属离子通过从非特异性静电屏蔽到位点特异性金属-配体配位的多种相互作用调控核酸构象和高级组装。配位活性金属离子（如Fe2?和Cu2?）可直接与磷酸和碱基配体作用促进核酸凝聚或交联，而Mg2?主要通过静电屏蔽和水合外层相互作用稳定核酸结构。
3.2.1 Fe2?介导的配位交联
Fe2?/核苷酸比例和反应物浓度调控颗粒尺寸，碱基依赖性Fe2?亲和力（A > G > C > T）调节分子堆积和DNA负载。Fe2?具有氧化还原活性，其氧化、竞争性金属/配体交换和蛋白质结合可能改变金属形态和组装完整性，需直接评估生物分布、清除、氧化还原相关脱靶效应和剂量依赖性毒性。
3.2.2 Cu2?-DNAzyme催化纳米杂合体
Cu2?与磷酸和核苷酸碱基供体位点结合，将DNAzyme凝聚为无载体纳米球，并通过单宁酸复合进一步稳定。Cu2?被谷胱甘肽还原为Cu?后通过Fenton样反应产生活性氧，而DNAzyme介导Mg2?依赖的VEGFR2 mRNA切割。Cu2?/Cu?互变在支持催化活性的同时可能产生脱靶氧化应激，需评估蛋白质诱导的金属再分布、系统处置、清除和剂量依赖性毒性。
3.2.3 Mg2?调控的核酸折叠与凝聚
Mg2?在Co(NH?)?3?驱动的DNA环状凝聚中主要作为途径修饰因子而非主要凝聚物种。Mg2?预结合抑制环状体成核但允许已有凝聚体更大程度生长，产生数量更少但更大的环状体。该效应取决于离子添加顺序、总阳离子浓度、温度和稀释。Mg2?具有氧化还原惰性且生理丰度高，其转化约束主要来自离子交换、生理稀释和系统离子负荷。
3.2.4 Co(NH?)?3?诱导的DNA环状凝聚
Co(NH?)?3?作为完整的、取代惰性的三价凝聚抗衡离子，通过电荷补偿、抗衡离子关联和水合介导接触促进链间结合和DNA塌缩为环状凝聚体。环状体尺寸和环状体/棒状体平衡取决于离子浓度、离子强度、DNA长度和拓扑结构以及成核与成核后生长的竞争。配位惰性不应等同于药理惰性，其在生物介质中的氧化还原稳定性、系统分布、清除和剂量依赖性毒性仍缺乏充分定义。
3.3 氢键、碱基堆积与多酚粘附
多酚辅助的核酸组装主要由酚羟基与核酸碱基或磷酸富集表面之间的多价氢键和疏水/芳香相互作用驱动。
3.3.1 单宁酸
TA作为多价超分子交联剂，核酸几何形状和模板构型强烈影响微粒、胶囊或粘附网络的形成，而密集的TA结合限制核酸酶可及性。这些相互作用的可逆性允许结构降解和载荷暴露，但定量保护-释放平衡窗口尚未建立。
3.3.2 姜黄素
姜黄素更适合解释为分子相互作用模型而非已确立的核酸载体。光谱证据表明其与DNA沟槽、碱基和磷酸基团结合，并伴随浓度依赖性聚集，但不支持受控纳米级凝聚、核酸酶保护、内涵体逃逸或体内分布的确立。
3.3.3 表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯
EGCG可通过协同氢键和疏水相互作用预复合siRNA，随后招募阳离子聚合物形成核-壳纳米颗粒。颗粒形成取决于EGCG/siRNA和聚合物/siRNA比例及聚合物架构。EGCG介导的预组织使低分子量聚合物能够以较低阳离子负担凝聚和保护siRNA。不同EGCG体系的摄取途径具有架构依赖性。
3.4 表面活性剂和膜辅助共组装
阳离子表面活性剂通过吸附到DNA骨架减少相邻磷酸基团间的静电排斥，促进DNA压缩。以Mg2?或十二烷基三甲基铵离子与DPPC脂质体和DNA形成的三元复合物为例，差示扫描量热法表征了复合物的热致相行为，为脂质-DNA识别过程和优化合成基因递送系统提供了机制见解。
3.5 核酸负载复合生物材料
3.5.1 脂质纳米颗粒
LNP是载体主导型组装体，其架构主要由脂质化学和加工条件决定。在快速酸性混合过程中，质子化可电离脂质静电复合核酸并驱动封装。辅助磷脂调节脂质堆积和膜融合性，胆固醇调节内部堆积和结构稳定性，PEG-脂质抑制聚集并约束粒径。生物流体中的血浆蛋白吸附形成动态蛋白冠，改变细胞识别和生物分布。内涵体酸化可促进可电离脂质介导的膜失稳，但摄取不应等同于有效逃逸。PEG化引入抗PEG抗体的转化权衡。
3.5.2 聚合物载体限域系统
通过将核酸聚复合物嵌入次级聚合物基质引入层级结构控制。聚复合物形成调控分子尺度载荷凝聚，而基质组成和制备条件调控颗粒组织、载荷保留和释放行为。PLGA/PEI/pDNA制剂研究表明加工条件可显著影响缓冲行为、细胞摄取、转染效率和细胞相容性。
3.5.3 PDRN负载海藻酸盐水凝胶
PDRN被视为非序列定义的DNA片段生物活性载荷。在氧化海藻酸盐体系中，离子交联和Schiff碱偶联建立基质，交联密度、溶胀和降解预期控制PDRN迁移和组织暴露。临床前模型报告了改善的伤口修复结果，但基质网络参数与PDRN暴露和生物反应之间的关系仍未解决。
3.5.4 PDRN整合透明质酸水凝胶
在HA-PDRN复合体系中，HA主要形成结构基质，PDRN作为非序列定义的再生生物活性组分。通过HA羧基与PDRN氨基的酰胺键共价偶联制备可注射水凝胶，表现出适宜的粘弹性、可注射性、水合性、生物降解性和生物相容性。小鼠植入模型中，该水凝胶维持体积超过24周，并伴随减弱的炎症反应和增强的胶原沉积。
4. 高级核酸架构的应用
4.1 药物递送
以质粒DNA为载荷、氧化谷胱甘肽交联的低分子量PEI为阳离子支架、海藻酸钠为阴离子调控组分，开发了结构稳定的三元球形SA@GP/DNA纳米颗粒。该体系通过静电吸引、疏水相互作用和氢键的协同优化实现核酸递送，说明递送性能不仅取决于静电DNA凝聚，还取决于凝聚强度、表面电荷、核酸酶保护、细胞摄取、内涵体逃逸、胞内释放和生物安全性的协调优化。
4.2 胞内和局部核酸递送
递送性能应由实验分辨的转运步骤而非总细胞积累定义。定量成像研究表明LNP-siRNA系统的内涵体逃逸可能极低效，摄取不能作为胞质可用性或功能性递送的替代指标。siRNA和mRNA需要胞质可及性，而pDNA还需核进入。
4.3 生物传感与分子诊断
碳点辅助DNA纳米球平台通过PEI修饰碳点与DNA的静电复合实现密集DNA负载并保护核酸探针免受酶降解。进一步掺入Mg2?构建基于DNAzyme的AND/OR逻辑门系统，可响应内源性人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1并区分肿瘤细胞中的miRNA-21和miRNA-155表达。此外，DNA折纸结构与固态纳米孔集成或工程化为跨膜通道，实现可编程分子转运和单分子核酸识别。适体功能化DNA折纸载体已支持C反应蛋白等单蛋白生物标志物的灵敏鉴定。
4.4 皮肤修复与化妆品科学
多核苷酸和PDRN（多来源于鱼类DNA）已被研究用于改善皮肤质地、水合、弹性、伤口修复、疤痕重塑和光老化损伤。其生物活性与核苷酸补救途径补充和PDRN激活腺苷A2A受体介导的抗炎和组织修复信号相关。一项针对慢性糖尿病足溃疡的随机双盲安慰剂对照试验报告了PDRN改善的愈合结果，为该适应症提供了临床证据。
4.5 疫苗接种、免疫调节与新兴生物界面
以壳聚糖寡糖封装编码SARS-CoV-2刺突和核衣壳抗原的DNA疫苗为例，静电结合将核酸凝聚为正电荷纳米颗粒，掺入聚乙烯醇/蔗糖微针后可穿透角质层并快速溶解释放。该制剂促进树突状细胞成熟和通过cGAS-STING介导的干扰素信号产生抗病毒免疫。微针介导的皮内免疫产生与肌内注射相当的中和抗体反应，并增强系统和粘膜T细胞反应。DNA折纸上CpG间距的纳米级控制可调节树突状细胞激活和下游适应性免疫。
5. 转化考量和准备度
转化要求将实验定义的核酸架构表达为可测量、可重复的产品规格。序列编程设计的质量控制始于寡核苷酸合成和纯化，确认序列同一性、链化学计量和正确组装结构比例。超分子共组装体的分析重点转向组装态分布、组分比例和残留未结合伙伴。载体主导制剂需验证载荷完整性和功能性释放。药代动力学和生物分布研究应区分完整组装体与释放核酸、载体相关物种和降解产物。人类证据高度平台依赖性：LNP具有最成熟的临床先例，球形核酸已进入早期人体研究，DNA折纸和tFNA治疗体系仍处于临床前阶段，PDRN和PN材料已有临床评估但证据质量存在异质性。
6. 结论
核酸架构应被视为调控分子保护、转运、胞内可用性和释放的制剂变量而非终点本身。设计原则包括：核酸保护和载荷释放应作为耦合变量优化；细胞摄取不应作为有效递送的替代指标；额外结构复杂性仅在产生可测量的递送或药理性能改善时保留；生物安全性应在架构层面评估；可制造性应在制剂设计阶段纳入。未来开发应聚焦于连接关键结构属性与递送剂量、胞内可用性或局部暴露、释放动力学、药理活性、安全性和批次重现性的定量结构-性能关系。
