《International Journal of Molecular Sciences》：Wide-Targeted Metabolomics Combined with Network Pharmacology Analysis Reveals Metabolite Dynamics and Optimal Harvest Time Across Developmental Stages in Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.
编辑推荐：
摘要专业翻译
五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）是一种传统药用植物，其果实富含木脂素、有机酸和黄酮类等多种生物活性成分。然而，果实发育过程中的生化动态变化尚未得到充分表征，这限制了五味子的有效栽培、采收和利用。研
摘要专业翻译
五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）是一种传统药用植物，其果实富含木脂素、有机酸和黄酮类等多种生物活性成分。然而，果实发育过程中的生化动态变化尚未得到充分表征，这限制了五味子的有效栽培、采收和利用。研究人员采用广靶代谢组学技术，结合果实生长的动态评估，分析了主要代谢物的时间变化规律，并确定了最佳采收窗口。结果表明，果实的形态变化主要发生在坐果后70至110天；鲜果质量在坐果后110天达到峰值。采收期果实呈深红色且质地坚硬，无软化迹象。同时，果穗重、单果重和果实纵径均达到峰值。在成熟过程中，木脂素水平显著下降，而萜类、有机酸和黄酮类化合物显著增加。变化最显著的化合物包括五味子素（schizandrin）、戈米辛N（gomisin N）、莽草酸（shikimic acid）、柠檬酸（citric acid）、γ-萜品烯（gamma-terpinene）和矢车菊素3-槐糖苷（cyanidin 3-sophoroside），这些是五味子果实的关键标志性化合物。网络药理学预测ESR1、RXRA、GATM、NCOA2和SONEA为核心靶点。这些发现为确定适时采收和建立五味子质量评价标准提供了依据。
论文解读
一、研究背景与意义
五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）隶属于五味子科（Schisandraceae）五味子属，是一种重要的木质藤本药用植物，其成熟果实为药用部位。五味子分为北五味子和南五味子两个分类单元，其中北五味子在木脂素和有机酸含量、药材纯净度、香气油性、干燥储存稳定性及药典标准符合度方面均优于南五味子。五味子主要分布于中国东北、日本和韩国，果实富含木脂素、黄酮类、有机酸、萜类和多糖等多种次生代谢产物，其干燥果实具有镇咳、保肝、抗炎和抗氧化等药理活性。
尽管五味子果实含有众多活性成分，但现有研究大多集中于木脂素类化合物，对其他代谢物的关注相对不足。木脂素是五味子的主要活性成分，包括五味子素、五味子乙素、五味子丙素、γ-五味子素、五味子酯甲和乙、五味子酚、去氧五味子素以及戈米辛A和G等二苯并环辛二烯类化合物。此外，萜类和黄酮类化合物也表现出广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗炎和抗氧化作用，且萜类和黄酮类化合物对果实香气和色泽有显著影响。有机酸和多糖也是五味子果实中积累的重要代谢物，其中柠檬酸、苹果酸和莽草酸是主要有机酸，柠檬酸占总酸的60%以上。
由于这些代谢物的生物合成受环境因素强烈影响，而对果实发育过程中代谢物积累的系统表征尚不充分，这直接限制了五味子的优化栽培和适时采收。采收不及时会直接导致五味子"五味"失衡和药材品质下降。因此，系统解析果实发育过程中代谢物积累的动态规律，对确定最佳采收期和建立质量评价标准具有重要的理论和实践意义。
二、主要技术方法
研究人员以沈阳农业大学中药材栽培基地种植的六年生北五味子自交纯系为材料，选取15株长势一致的植株，每5株为一组生物学重复，在坐果后70、90、110和130天四个发育阶段（T1–T4）采集果实样本。采用基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的广靶代谢组学技术进行代谢物 profiling，使用Vanquish UHPLC系统配合ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱和Q Exactive质谱仪，在正负离子模式下采集数据。原始数据经XCMS软件进行特征检测、保留时间校正和峰对齐，代谢物注释基于精确质量和二级质谱（MS/MS）谱图匹配HMDB、LipidMaps、KEGG、ChEBI及自建数据库。差异代谢物筛选采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合VIP值（>1）和p值（<0.05）双重阈值。KEGG通路富集分析使用MetaboAnalyst平台。网络药理学分析通过STITCH、HMDB、CTD、SwissTargetPrediction、GeneCards和DisGeNET等数据库获取化合物靶点和疾病靶点，利用STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并通过Cytoscape可视化。
三、研究结果
2.1 果实发育过程中的生理变化
研究人员基于果皮颜色、果实大小重量、果肉硬度以及花青素和可溶性固形物含量等综合生理指标，将果实发育划分为四个阶段：T1（70天）果实较小、绿色、质地坚硬；T2（90天）果实膨大并开始部分转红；T3（110天）果实品质指标达到峰值，颜色转为深红、质地仍坚硬，花青素和可溶性固形物含量显著增加；T4（130天）果实呈深红色但质地变软。果穗级性状随发育持续增加并在T3达到峰值，平均单穗鲜重T1–T4分别为9.24 g、10.01 g、11.53 g和11.06 g。单果鲜重从T1的0.47 g升至T3–T4的0.59 g，果实纵径从9.44 mm增至T3的10.70 mm。总体上，果穗重、单果重和果实纵径在T1至T3呈明显上升趋势，至T4略有稳定或轻微下降。
2.2 代谢物的多变量分析
研究人员采用PCA、PLS-DA和OPLS-DA评估数据质量并表征组间分离，置换检验显示模型稳定且无过拟合，R2和Q2接近1。PCA得分图和代谢物热图显示各阶段生物学重复紧密聚集，表明重复性良好。结果揭示果实内物质变化在T2至T3期间最为显著。
2.3 四个发育阶段差异积累代谢物的鉴定
研究人员共鉴定出1073种代谢物，涵盖黄酮类、萜类、酚类、苯丙素类、酮类、醛类和有机酸等。检测到关键相关成分包括木脂素类（五味子素、开环异落叶松脂素、五味子丙素、戈米辛N）、有机酸类（莽草酸、柠檬酸、L-苹果酸、草酰乙酸、棕榈油酸）、糖类（阿拉伯醇、半乳糖1-磷酸、D-甘露糖、2-脱氧-D-葡萄糖、海藻糖）、黄酮类（槲皮素3-鼠李糖苷-7-葡萄糖苷、原花青素C1、槲皮素3-半乳糖苷、矢车菊素3-槐糖苷、山柰酚）、萜类（柠檬烯、木香烯内酯、积雪草酸）及多种植物激素。
差异代谢物筛选阈值为p < 0.05且VIP > 1。T2相对T1含130种差异代谢物，T3相对T2含160种，T4相对T3含162种。T2与T1比较中，70种上调和60种下调，花青素合成前体花旗松素（taxifolin）增幅最显著，表明该阶段是花青素积累的关键时期；糖苷和抗坏血酸协同上调，而磷脂下调标志着果实从发育生长转向物质积累。T3与T2比较中，52种上调和108种下调，莽草酸中间产物显著增加，茉莉酸信号增强可能促进次生代谢物合成。T4与T3比较中，96种上调和66种下调，脂肪酸代谢、糖基化反应和糖酵解途径的关键物质显著上调，推测该过程是果实发育和物质积累的关键时期。
2.4 不同发育阶段关键代谢物分析
木脂素类成分在果实成熟过程中显著下降，尤其以五味子素和戈米辛N在T2和T3阶段降幅最大。β-佩尔亭（beta-peltatin）作为α-鬼臼毒素的甲基醚衍生物，其相对丰度随果实成熟显著增加，提示五味子可能具有抗肿瘤潜力。有机酸方面，L-苹果酸在整个发育过程中略有下降，柠檬酸从T1至T3下降后随成熟回升，而莽草酸持续增加且在成熟果实（T4）中显著高于幼果（T1），表明其在果实酸度形成中起关键作用。糖类中，海藻糖在T1至T2显著积累，2-脱氧-D-葡萄糖在T3至T4显著积累。
萜类化合物中，赤霉素a44二酸、去氧马钱苷、马鲁比因、赤霉素a53、索拉韦替酮、脱落酸和赤霉素a51显著下调，而辣椒素醇、赤霉素a8、獐牙菜苷、积雪草酸、藏红花苦素、γ-萜品烯、车叶草苷酸和赤霉素a8-分解代谢物显著上调。脱落酸（ABA）相对丰度在果实发育过程中显著下降，赤霉素（GA）表现出明显波动，提示ABA和GA在果实发育中发挥重要调控作用。γ-萜品烯随果实成熟显著积累，推测其可能是五味子果实挥发油形成的关键物质。
黄酮类化合物中，山柰酚、槲皮素3-鼠李糖苷-7-葡萄糖苷、马里宁、色原酮-4-酮、美迪紫檀素和矢车菊素3-槐糖苷显著增加，而黄酮醇碱+4O、O-己-二己-戊糖、穗花杉双黄酮、表儿茶素、扁蓄苷和高圣草素下降。矢车菊素3-槐糖苷的显著上升表明其在果实转色中起关键作用，是五味子果实着色的主要贡献者。
2.5 差异代谢物的KEGG富集分析
T2与T1比较中显著富集12条通路，包括精氨酸和脯氨酸代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、C5支链二元酸代谢、黄酮降解、精氨酸生物合成、嘧啶代谢等，差异代谢物主要富集在氨基酸代谢通路、次生代谢物合成通路和基础物质代谢通路，表明该阶段果实主要从事发育和花青素积累。T3与T2比较中富集3条通路：苯丙氨酸代谢、咖啡因代谢和阿特拉津降解，差异代谢物主要集中在次生代谢物合成通路，苯丙素类和有机酸类物质水平显著增加。T4与T3比较中富集5条通路：癌症中心碳代谢、玉米素生物合成、氧化磷酸化、植物次生代谢物生物合成和甲苯降解，差异代谢物主要集中于核心碳代谢和次生代谢通路。
2.6 成熟期花青素和木脂素通路相关成分的变化
在花青素生物合成通路中，二氢槲皮素和矢车菊素3-槐糖苷随果实成熟显著增加，其中矢车菊素3-槐糖苷在T4阶段达到峰值。原花青素通路中，表儿茶素相对丰度随成熟下降，而原花青素C1和原花青素B2呈现先升后降的趋势。在木脂素生物合成通路中，马兜铃素、二氢愈创木酸、戈米辛J、五味子素、戈米辛N和五味子丙素的水平均随果实成熟显著下降。值得注意的是，五味子素作为主要活性成分，其相对丰度在T3阶段最低。结果表明木脂素和花青素的相对丰度在果实成熟过程中呈现相反的变化趋势。
2.7 成分-靶点-疾病网络揭示关键通路和治疗关联
GO富集分析显示186条通路显著富集，最显著的是节律过程、雌二醇响应、类固醇激素响应、细胞对药物的响应、胆汁酸和胆汁盐转运以及血压负调控。KEGG富集鉴定出13个关键化合物连接15个靶点和109条通路，其中32条通路显著富集，包括甲状腺激素信号通路、化学致癌-受体激活、雌激素信号、乳腺癌、酒精性肝病和酪氨酸代谢。富集通路映射到15个靶点：NCOA2、SCN5A、ADRB2、GRIA2、NOS2、ESR1、GSK3B、ESR2、CCNA2、GATM、NCOA1、RXRA、ADRB1、ADH1B和ADH1A。ESR1、RXRA、GATM、NCOA2和SONEA是网络中的核心靶点，广泛参与cAMP和Wnt信号通路、糖酵解/糖异生及多种癌症相关通路。数据库注释还将这些化合物与酒精性肝病、甲状腺癌、乳腺癌、阿尔茨海默病和皮肤病等疾病相关联，桑酮、白鲜酮、紫云英苷、开环异落叶松脂素、血清素和雌三醇是重要物质。
四、讨论与结论
讨论部分指出，五味子果实中木脂素在成熟过程中显著下调，而有机酸和黄酮类增加，这与既往研究一致。木脂素的生物合成受环境信号和激素信号通过复杂调控网络塑造，ABA和GA可能通过调控相关基因表达来调节果实中木脂素的积累。有机酸和花青素是果实品质的主要决定因素，有机酸通过降低pH稳定花青素从而增强抗氧化活性，二者存在功能关联。采收时机对药用植物产量和品质有重要影响，不同生长阶段的活性成分、生物量分配和药用价值各不相同。本研究中，果实形态在整个发育过程中变化显著，T3阶段果实达到最大尺寸和最高产量，但随后20天产量略有下降，而有机酸等代谢物相对丰度大幅增加。综合来看，五味子果实的最佳采收时间为坐果后110天（T3阶段）。若以木脂素提取为目的，建议在坐果后70天采收；若以有机酸和花青素为目标，则坐果后130天采收更为适宜。
研究结论：本研究采用广靶代谢组学表征了五味子果实不同发育阶段的代谢物变化，发现主要生物活性成分木脂素的相对丰度随果实成熟显著下降，而有机酸和花青素水平大幅增加。其中五味子素、戈米辛N、莽草酸、柠檬酸、γ-萜品烯和矢车菊素3-槐糖苷变化最为显著，可作为监测果实发育的标志性化合物。果实形态在成熟过程中变化显著，最大产量出现在T3阶段。网络药理学分析发现ESR1、RXRA、GATM、NCOA2和SONEA为核心靶点。这些发现鉴定了果实发育过程中的关键标志代谢物，为确定五味子果实最佳采收时间建立了理论框架。
