《International Journal of Molecular Sciences》：A Proof-of-Concept Study: Reference Transcriptome Choice as a Hidden Analytical Variable in Breast Cancer RNA-Seq Analysis
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参考基因组与参考转录组是RNA测序（RNA-seq）分析的基础组成部分，可影响转录本定量及下游差异表达结果。尽管GRCh38是目前的人类参考基因组版本，但GRCh37在研究及临床生物信息学工作流程中仍在使用。参考转录组选择对乳腺癌转录组推断的影响程度尚未得到充
参考基因组与参考转录组是RNA测序（RNA-seq）分析的基础组成部分，可影响转录本定量及下游差异表达结果。尽管GRCh38是目前的人类参考基因组版本，但GRCh37在研究及临床生物信息学工作流程中仍在使用。参考转录组选择对乳腺癌转录组推断的影响程度尚未得到充分表征。研究人员对来自欧洲核苷酸档案库（European Nucleotide Archive，ENA；项目编号PRJEB4829）的公开RNA-seq数据进行了比较分析，该数据集包含两个MCF7乳腺癌细胞系样本和两个健康乳腺组织样本。研究人员采用基于GRCh37和GRCh38的参考转录组，应用了完全相同的预处理、转录本定量和差异表达工作流程。进一步通过比较同一批样本在两种参考转录组下的定量结果，考察了参考转录组依赖性变异。研究人员评估了差异表达基因（DEGs）的一致性及通路富集情况，并针对MammaPrint和Naderi表达特征以及所选遗传性癌症基因检测panel所包含的基因，评估了其对参考转录组选择的敏感性。MCF7与正常组织比较中，使用GRCh37鉴定出15,950个差异表达基因，使用GRCh38鉴定出16,348个，两种分析共享13,899个基因。两种注释下最显著富集的Hallmark和KEGG通路也具有一致性。主成分分析（PCA）显示，MCF7与正常组织比较中变异的主导模式与生物学状态相关。相比之下，当同一批MCF7样本使用不同参考转录组进行定量时，参考转录组选择成为变异的主要来源。所评估的预后特征及遗传性癌症panel中各基因的表达中位数在两种参考转录组之间无显著差异。然而，个别癌症相关基因，包括PTEN、RAD51D、NANOG和SOX11，表现出参考转录组依赖性表达差异。在本概念验证分析中，参考转录组选择在RNA-seq定量和差异表达方面产生了可测量的差异，而广泛的生物学模式和已确立基因特征的整体表达相对稳定。当生物学异质性有限时，参考转录组依赖性变异变得尤为明显，提示参考转录组选择可构成转录组研究中一个隐藏的分析变量。这些发现支持对参考注释进行明确报告和版本控制，并强调在得出临床结论之前，需要在更大规模、独立重复的乳腺癌队列中进行验证。
乳腺癌RNA测序分析中参考转录组选择的隐藏效应：一项概念验证研究的系统解读
一、研究背景与意义
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症死亡的第二大原因，约影响七分之一的女性一生。随着高通量测序技术的发展，转录组层面的基因表达谱分析已成为理解乳腺癌发生机制、实现个体化治疗的关键工具。RNA-seq分析高度依赖参考基因组和参考转录组，其选择直接影响转录本定量、差异表达基因（DEGs）鉴定以及下游生物学解释。目前，GRCh38是现行的人类参考基因组版本，但GRCh37在研究及临床生物信息学工作流程中仍被广泛使用。不同实验室之间在参考转录组选择上的差异，可能导致相同测序数据产生不同的分析结果，从而影响研究的可重复性和可比性。然而，参考转录组选择对乳腺癌转录组分析结果的影响程度此前尚未被系统阐明。因此，研究人员开展了一项概念验证研究，旨在探究参考转录组选择是否构成RNA-seq分析中一个隐藏的分析变量。
二、研究设计与核心发现
研究人员利用来自欧洲核苷酸档案库（ENA，项目编号PRJEB4829）的公开RNA-seq数据，包括两个MCF7乳腺癌细胞系样本和两个健康乳腺组织样本。通过保持测序数据和生物信息学工作流程完全一致，仅改变参考转录组版本（GRCh37 vs GRCh38），系统比较了转录本定量、差异表达分析、通路富集以及临床相关基因集表达模式的变化。研究发现，在MCF7与正常组织的比较中，两种参考转录组鉴定出的差异表达基因数量分别为15,950（GRCh37）和16,348（GRCh38），共享13,899个基因。两种注释下最显著富集的Hallmark和KEGG通路高度一致。主成分分析（PCA）显示，在癌症与正常组织比较中，PC1解释了约97%的方差，生物学状态是变异的主导模式。然而，在仅包含癌症样本的比较中，参考转录组选择成为变异的主要来源；在仅包含正常样本的比较中，参考转录组相关变异沿PC2分布（占40%方差），而生物学差异沿PC1分布（占58%方差）。这一结果表明，当生物学异质性有限时，参考转录组选择的影响变得更加显著。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：使用FastQC v0.11.9和MultiQC v1.9进行质量控制；使用Trimmomatic v0.39进行质量修剪；使用Kallisto v0.46.2基于伪比对过程进行转录本表达定量；使用DESeq2 v1.50.2进行差异表达分析；使用Spearman相关分析评估两种参考转录组结果的一致性；使用主成分分析（PCA）评估变异来源；使用Wilcoxon符号秩检验比较临床相关基因集在两种参考转录组下的表达差异；使用百分位自举置信区间（10,000次自举）鉴定异常表达基因；使用MSigDB Hallmark和KEGG数据库进行通路富集分析。参考转录组分别取自Ensembl数据库的GRCh38.p13和GRCh37.p13版本。
四、研究结果
4.1 生物信息学工作流程
质量修剪导致每个样本丢弃1.92%至3.09%的读段。GRCh38参考转录组包含248,592个转录本（190,522个cDNA和58,070个ncRNA序列），GRCh37包含215,170个转录本（180,253个cDNA和34,917个ncRNA）。两种参考转录组在正常和癌症样本中鉴定出的最高表达转录本一致（分别为ENST00000390237和ENST00000361227）。
4.2 病例-对照比较
在包含癌症和正常样本的PCA中，PC1约占97%的总方差，两种方法均按生物学状态分离样本。GRCh37鉴定出15,950个DEGs（7,342个上调，8,608个下调），GRCh38鉴定出16,348个DEGs（7,529个上调，8,819个下调），共享13,899个基因。所有基因的log2FC估计值Spearman相关系数为0.972，显著DEGs的相关系数为0.99，表明两种参考转录组结果高度一致。基因排序比较显示，多数基因在两种参考转录组间仅发生较小移位，但部分基因如PCDHB5、RIOX1、HYPK、CDKL5、PCSK1N、MAB21L3、PNRC2、AC115102.1、D21S2088E和PLS3表现出较大排序差异。Hallmark富集分析中，两种方法鉴定出基本一致的显著基因特征，仅三个通路存在差异（两个仅在GRCh37中富集，一个仅在GRCh38中富集）。KEGG分析中，90个显著富集通路为两种方法共有，GRCh37特有4个通路，GRCh38特有1个通路。
4.3 病例-病例和对照-对照比较
在仅包含癌症样本的比较中，PCA显示样本沿参考转录组来源清晰分离，表明参考转录组选择成为变异的主要来源。在仅包含正常样本的比较中，PC1（58%方差）主要分离生物学样本，而参考转录组相关分离沿PC2（40%方差）分布。基因表达水平在两种参考转录组间呈强正相关（Spearman's ρ = 0.965）。
4.4 临床相关基因评估
对MammaPrint、Naderi表达特征以及WarsawGenomics、FullGentGenetics和MyGenomics三个诊断基因panel的基因进行Wilcoxon符号秩检验，结果显示所有基因子集在GRCh37和GRCh38定量结果之间的中位表达水平均无显著差异。然而，通过百分位自举置信区间鉴定出若干异常表达基因，包括PTEN、RAD51D、MLLT1、TXNIP、PALM2-AKAP2和HSPA14等。其中，PTEN和RAD51D在多种诊断panel和两种条件下均出现，而NANOG和SOX11仅在癌症样本中表现出参考转录组依赖性差异。
五、讨论与结论
本研究表明，参考转录组选择是RNA-seq分析中一个可测量且不可忽视的变异来源。在广泛的生物学比较中，主要生物学结论保持稳定；但当生物学异质性有限时，参考转录组选择的影响变得尤为突出。已确立的临床基因表达特征和常用诊断基因panel的整体表达模式相对稳定，但个别癌症相关基因如PTEN、RAD51D、NANOG和SOX11可能因转录本定义、外显子结构或剪接变体的注释差异而表现出参考依赖性表达差异。PTEN作为关键肿瘤抑制基因，其表达差异可能源于GRCh37和GRCh38之间转录本定义的差异影响读段伪比对和定量。研究还发现，MDC1、RASSF5、CDKN1C、MSRA和PLS3等与乳腺癌相关的基因在两种参考转录组间的排序存在差异，这可能影响基于表达排序的候选基因筛选结果。
研究结论指出，参考转录组构成RNA-seq研究中一个"隐藏的技术变量"。虽然主要生物学结论可能保持稳定，但转录组选择可影响精细层面的解释和可重复性。因此，采用更新且明确报告的参考转录组，并定期重新分析已有数据集，对于确保方法学透明度和跨研究可比性至关重要。随着精准肿瘤学日益依赖高分辨率分子谱分析，仔细考虑参考基因组和转录组版本应成为临床生物信息学最佳实践的重要组成部分。研究人员同时指出，本研究为概念验证性质，样本量有限，需要在更大规模、独立验证的乳腺癌队列中进一步确认这些发现的临床意义。
