基于TH内源启动子驱动neo的遗传霉素选择富集TH+多巴胺能神经元并促进患者来源iPSC系比较

《International Journal of Molecular Sciences》：A New Selection Strategy to Enrich Dopaminergic Neurons Facilitates Comparisons Between Patient iPSC-Derived Lines

　　

对来自帕金森综合征（parkinsonism）不一致患者（尤其兄弟姐妹）的诱导多能干细胞（iPSCs）所分化的多巴胺能（DA）神经元进行比较研究，为探索帕金森病（PD）发病机制相关因素提供了有价值的模型。然而，不同个体来源iPSC系间分化效率的固有异质性使此类研究复杂化。为解决该技术挑战，研究人员设计了一种选择策略，以富集表达酪氨酸羟化酶（TH）的DA神经元。将新霉素抗性基因（neo）插入TH基因C端（C-terminus），使其表达受内源性启动子调控。利用健康个体（HT711）来源iPSC分化神经元，研究人员通过遗传霉素（geneticin）选择实现了TH⁺神经元的选择性富集，且未损害分化能力，Western blot、免疫细胞化学（immunocytochemistry）和流式细胞术（flow cytometry）证实了这一点。研究人员随后将该方法应用于HT711两名兄弟姐妹来源iPSCs，一人仅患Gaucher病（GD），另一人同时患PD和GD。通过全细胞蛋白质组学（whole-cell proteomics）定量多个DA神经元标志物，证实三种细胞系中可比富集，表明新方法可应用于不同个体来源iPSC系以标准化DA神经元培养。尽管本文聚焦方法学进展，对同一全细胞蛋白质组学数据集、检查可能与疾病状态相关分子特征的伴随分析已另行报道。

本研究围绕患者来源诱导多能干细胞（iPSCs）分化为多巴胺能（DA）神经元时存在的系间异质性，开发并验证一种基于遗传霉素（geneticin）选择的DA神经元富集方法，以促进不同个体来源iPSC系之间的标准化比较。研究背景在于，DA神经元进行性退变是帕金森病（PD）核心运动症状的定义性特征和原因，但导致该神经元丢失的细胞机制仍 largely 未明；来自PD不一致个体（尤其兄弟姐妹）的iPSCs分化DA神经元，为在受累细胞类型中研究致病机制提供了保持遗传背景的模型。然而，不同个体来源iPSC系及培养批次间DA神经元分化效率存在固有异质性，可能与被研究基因型之外的供体整体遗传背景有关；单细胞RNA测序分析95例患者来源iPSC系显示，分化细胞平均约80%为MAP2阳性，但仅约20%同时表达TH，疾病相关变化可能被培养异质性掩盖。既有方法如逐系优化分化条件耗时并可能引入偏倚，谱系决定转录因子诱导DA神经元需联合外源 patterning cues，丝裂霉素C（MMC）可去除增殖性前体，荧光激活细胞分选（FACS）可用于纯化DA前体或TH⁺DA神经元及遗传工程表达荧光蛋白的细胞，MAP2启动子驱动的neo置于AAVS1位点也曾用于DA神经元选择，但MAP2为泛神经元标志物。为此，研究人员将neo插入TH位点并置于内源TH启动子控制下，在三个姐妹来源iPSC系中验证选择效果，以标准化DA神经元培养并服务于罕见临床样本比较。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究样本来自美国NIH IRB批准临床方案86HG0096下三姐妹皮肤成纤维细胞重编程iPSCs：HT707仅GD（60岁）、HT708 GD+PD（56岁，PD诊断后）、HT711健康（58岁）。采用CRISPR-Cas9同源定向修复（HDR）在TH位点插入neo，借助筛选标记和CRE/loxP切除获得单克隆，经PCR和核型鉴定；按Kim等方案定向分化为中脑多巴胺能（mDA）神经元；以遗传霉素选择富集；通过Western blot、免疫细胞化学（ICC）、流式细胞术和全细胞蛋白质组学（DIA-FAIMS及库免费搜索）验证。

研究结果如下。

2.1 临床样本：研究人员获取三姐妹皮肤成纤维细胞并重编程为iPSCs；重编程iPSCs呈预期形态，OCT3/4、Tra1-60和Nanog等多能性标志物表达一致，Western blot和流式细胞术证实。

2.2 通过遗传霉素选择实现DA神经元富集的iPSC系基因工程：研究人员采用CRISPR-Cas9和HDR，在TH基因外显子14后、P2A自剪切肽之后插入neo，使neo表达受内源TH启动子驱动；供体载体含EF1α驱动、由T2A分隔的嘌呤霉素抗性基因和红色荧光蛋白mRuby选择盒，两侧为loxP位点，便于在鉴定正确编辑iPSC后切除；经嘌呤霉素富集、CRE-GFP转染切除选择盒、FACS分选单细胞克隆及PCR鉴定，获得HT707 TH-neo、HT708 TH-neo和HT711 TH-neo；这些编辑系形态未变且核型正常。

2.3 Neo基因整合不干扰iPSCs向DA神经元分化：研究人员将HT711与HT711 TH-neo按Kim等方案分化为DA神经元，以第37天TH⁺DA神经元百分比评估分化效率；免疫荧光和流式细胞术显示两系分化效率相当，表明neo整合未扰动分化能力。

2.4 TH阳性DA神经元中酪氨酸羟化酶与Neo共表达：第37天免疫染色显示，neo编码的氨基糖苷3′-磷酸转移酶II（APT II）仅表达于HT711 TH-neo分化的TH⁺DA神经元，HT711中背景染色极低，表明APT II受TH启动子控制且抗体特异；CellTiter-Glo活力检测显示，在TH表达开始前的神经元前体阶段（第16天），遗传霉素同样降低HT711与HT711 TH-neo前体活力，250 μg/mL可有效消除神经元前体；第36天、经250 μg/mL遗传霉素处理10天后，HT711 TH-neo培养约50%细胞存活，而HT711培养几乎全部死亡，表明遗传霉素选择可消除不表达APT II的神经元。

2.5 遗传霉素处理提高TH⁺DA神经元比例：免疫荧光显示250 μg/mL遗传霉素处理10天使TH⁺细胞比例由10%增至35%，流式细胞术显示由10%增至45%；Western blot显示遗传霉素选择后TH表达呈剂量依赖性增加，250 μg/mL时约增加2.5倍。

2.6 细胞蛋白质组学证实患者来源iPSC系间DA神经元标准化：研究人员采用自动化样品制备、数据非依赖采集（DIA）结合高场不对称波形离子迁移谱（FAIMS）及优化的库免费DIA数据库搜索策略，对遗传霉素或载体处理10天并成熟至第75天的培养物进行全细胞蛋白质组学分析，检测到超过8800种蛋白质；遗传霉素处理后三系均显示TH和将L-DOPA转化为多巴胺的多巴脱羧酶（DDC）丰度增加（TH的log₂FC分别为2.14、0.70、1.22，校正p分别<1×10^?3、<2.5×10^?5、<3×10^?6；DDC的log₂FC分别为2.14、0.68、1.75，校正p分别<8×10^?5、<1×10^?4、<5×10^?7）；其他DA神经元标志物亦增强，包括PD易感A9 DA神经元特异性标志物ALDH1A1在两系中增加（708 TH-neo log₂FC 1.60，校正p<0.002；711 TH-neo log₂FC 2.32，p=0.013），以及Nurr1和VMAT2；泛神经元标志物MAP2和TUBB3未显著富集，与既往报道一致。

讨论部分总结：研究人员指出，对罕见或独特临床病例的深入评估有助于揭示分子机制；不同患者来源iPSC系分化的疾病相关细胞类型可再现个体特异性分子特征。为促进个体间准确比较，研究针对即使遗传相关个体来源iPSC系间仍存在的分化异质性，开发可富集目标细胞类型的工具。既往针对健康对照特定iPSC系优化分化方案、对选定细胞系深度表型分析及大规模协作项目数据图谱，在罕见病研究中可能不适用。将neo置于TH启动子后，研究人员先验证neo不干扰第37天分化能力；第75天全细胞蛋白质组学显示HT711与HT711 TH-neo紧密聚类，提示分化能力基本未变。研究确认neo仅在TH⁺DA神经元中表达，并通过亲本系与相应TH-neo系细胞存活比较证明遗传霉素选择有效。HT711初始TH⁺神经元比例低于Kim等报道，但与更大规模iPSC衍生神经元报道水平相当；逐系优化CHIR水平在比较不同iPSC系时不可行，促使研究人员开发更适用于患者来源神经元的方法。多种方法显示遗传霉素选择后TH⁺神经元富集：免疫染色显示TH⁺神经元比例增加，归因于缺乏TH的DAPI染色细胞核减少；流式细胞术显示相当程度增强且分析细胞数更多；活力实验显示HT711-TH-neo神经元约50%存活、HT711神经元几乎全部死亡，表明遗传霉素通过消除TH^-细胞富集TH⁺神经元，产量下降是纯度提升的合理权衡；HT711非编辑细胞被消除也提示选择后免疫染色并非全部阳性可能源于染色敏感性有限。供体载体不含启动子，neo仅通过内源TH启动子表达；鉴于遗传霉素选择未改变AAVS1位点人MAP2启动子驱动新霉素抗性基因的iPSC系来源TH⁺神经元电生理特性，研究人员认为该方法为比较多个患者iPSC系来源TH⁺神经元提供了有价值工具。该方法与荧光报告基因偶联TH表达或基于表面标志物的FACS等既往方法互补，优势在于无需解离为单细胞即可富集细胞，并可在TH表达开始后成熟任意时间应用，为保留完整突触的细胞培养药物筛选提供机会。该新方法已成功促进针对GD和PD表型的多种多组学分析；当前报告完全聚焦富集方法本身的开发与验证，即构建TH启动子驱动新霉素抗性盒的iPSC系并表征所得富集DA神经元群体，为使用多个体来源iPSC系进行疾病建模的科研群体提供工具。

研究结论翻译：总之，研究人员表明，将遗传霉素抗性与内源性TH表达偶联，可用于标准化不同个体来源iPSC系的多巴胺能培养。该方法带来的多巴胺能神经元培养一致性提高，在评估罕见临床样本以识别疾病相关表型时尤其有用。