《International Journal of Molecular Sciences》：Validation of Reference Genes for RT-qPCR Normalization in Saccharum Genotypes During Smut Infection
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甘蔗和能源甘蔗（Saccharum spp. hybrids）的产量受到由真菌 Sporisorium scitamineum 引起的黑穗病的显著威胁。基因表达研究对于理解该病理系统中的分子响应至关重要；然而，参考基因稳定性可能随基因型、植物器官和感染阶段而变
甘蔗和能源甘蔗（Saccharum spp. hybrids）的产量受到由真菌 Sporisorium scitamineum 引起的黑穗病的显著威胁。基因表达研究对于理解该病理系统中的分子响应至关重要；然而，参考基因稳定性可能随基因型、植物器官和感染阶段而变化，这凸显了在每项实验特定条件下进行系统验证的必要性。本研究在甘蔗 IACSP02-1064（中等抗性）和能源甘蔗 Vertix 10（感病）的芽组织中，于感染进程（12、24、48和120 hpi（hours post-inoculation，接种后小时））评估了8个候选基因。采用 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 算法评估表达稳定性。对于 IACSP02-1064，ACAD（Acyl-CoA dehydrogenase family member 10，酰基辅酶A脱氢酶家族成员10）和 GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脱氢酶）为最稳定基因，而 GAPDH/ACAD 和 ACAD/UBQ2（Ubiquitin 2，泛素2）被确定为最佳组合。对于 Vertix 10，GAPDH、UBQ2 和 ACAD 显示最高稳定性，推荐 GAPDH/UBQ2、ACAD/GAPDH 和 ACAD/SARMp1 用于归一化。研究人员进一步通过分析 ScSPL19（SQUAMOSA promoter-binding protein-like 19 from Saccharum spp.）表达评估所选参考基因；该基因属于 SQUAMOSA PROMOTER-BINDING PROTEIN-LIKE（SPL）转录因子家族，其成员此前已被报道对黑穗病感染产生响应。使用最稳定和最不稳定参考基因对进行归一化分析，结果显示，当以最稳定参考基因对（GAPDH/ACAD）归一化时，ScSPL19 呈现差异性的时间调控。这些结果支持该参考基因组合在所评估条件下用于准确相对基因表达分析的适用性。
研究背景与问题：甘蔗（Saccharum spp. hybrid）是禾本科重要经济作物，全球种植面积超过2700万公顷，约占全球食糖产量的80%和生物燃料产量的40%；能源甘蔗作为高纤维甘蔗杂交种，因生物量高并适于第二代生物能源生产而受到关注。甘蔗生产常受干旱、温度波动及病原物和害虫等生物与非生物胁迫限制，其中由活体营养真菌 Sporisorium scitamineum 引起的黑穗病是重要威胁。病原通常侵染芽组织或顶端分生组织，诱导代谢重编程，干扰正常生长并形成含冬孢子的鞭状结构；感病品种中产量损失可达39%–56%，宿根周期可达73%。RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）是解析植物–病原互作转录变化的重要工具，但相对定量依赖稳定参考基因（reference genes，用于归一化的内参基因）归一化。既往在甘蔗不同基因型和胁迫下评估候选参考基因，但稳定性排序常不一致，反映宿主基因型、真菌分离物和实验条件的影响，因此需在每项研究中系统验证。尤其缺乏对 IACSP02-1064（中等抗黑穗病）和 Vertix 10（感黑穗病）的比较评估；由于抗、感基因型比较有助于阐明抗性分子基础，需在基因型内及跨基因型可靠归一化。研究人员据此评估8个候选参考基因在接种 S. scitamineum 后芽组织4个早期时间点的转录稳定性，并用 ScSPL19（SQUAMOSA promoter-binding protein-like 19 from Saccharum spp.）表达评价参考基因选择影响。结论是 GAPDH/ACAD 等组合在两种基因型中表现稳定，参考基因选择会影响 ScSPL19 响应检测的时间与解释；该研究为甘蔗–黑穗病病理系统中可靠 RT-qPCR 归一化及基因型特异性转录响应研究提供依据。
关键技术方法（不超过250字）：以甘蔗 IACSP02-1064（中等抗性；Agronomic Institute (IAC), Ribeirao Preto, Brazil提供）和能源甘蔗 Vertix 10（感病；Nuseed Brazil提供）芽组织为材料；S. scitamineum 冬孢子采自巴西 Ribeir?o Preto, S?o Paulo, Brazil甘蔗中心既往感染试验田。设接种与mock，在12、24、48、120 hpi取样，每处理3个生物学重复（每重复9芽，共27芽）。RT-qPCR检测8个候选参考基因；LinRegPCR 7.5计算扩增效率；geNorm v3.5、NormFinder、BestKeeper v.1评估稳定性；geNorm配对变异确定最优参考基因数；以最稳定和最不稳定参考基因对归一化 ScSPL19，采用2
?ΔΔCt、two-way ANOVA/混合效应分析和Bonferroni检验。
研究结果：2.1 引物效率与特异性：通过初步优化确定各候选参考基因引物浓度，并在最终条件下检测扩增效率、相关系数、Ct均值和标准差；两种基因型中引物效率为91%–102%，多数基因 R
2 > 0.99，IACSP02-1064 中 SARMp1（Serine/arginine repetitive matrix protein 1，丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白1）为例外；熔解曲线分析显示单一荧光峰，未见非特异性扩增产物和引物二聚体。2.2 候选参考基因稳定性：采用 BestKeeper、NormFinder 和 geNorm 独立评估8个候选基因；IACSP02-1064 中 BestKeeper 和 NormFinder 均将 ACAD 列为最稳定基因，geNorm 将 GAPDH 列为首位；Vertix 10 中 BestKeeper 和 NormFinder 将 GAPDH 列为最稳定候选，geNorm 优先 ACAD，GAPDH 和 UBQ2 在该基因型中 consistently 属于最稳定基因之列；与最稳定候选相比，各算法对最不稳定候选的识别差异较大。2.3 最优参考基因数目：geNorm 的配对变异分析显示两种基因型 V
2/3 均低于 V < 0.15 阈值，表明两个参考基因足以可靠归一化，加入第三个参考基因未显著改善；NormFinder 将 ACAD/UBQ2 列为 IACSP02-1064 最优组合，其次为 ACAD/GAPDH；geNorm 将 ACAD/GAPDH 列为 IACSP02-1064 最稳定组合，将 GAPDH/UBQ2 列为 Vertix 10 最稳定组合。2.4 用 ScSPL19 评价参考基因性能：以共同表现较好的 GAPDH/ACAD 和最不稳定组合 25SrRNA2/ACT（25S ribosomal RNA 2/Actin，25S核糖体RNA2/肌动蛋白）归一化 ScSPL19，比较接种与mock在12、24、48、120 hpi的表达；IACSP02-1064 在以 GAPDH/ACAD 归一化时于24和48 hpi接种组下调，而以25SrRNA2/ACT归一化时无统计学显著差异；Vertix 10 在以 GAPDH/ACAD 归一化时于120 hpi接种组下调，而以25SrRNA2/ACT归一化时于48 hpi下调；说明参考基因选择可影响目标基因响应检测的时间及结果解释。
讨论总结：讨论指出，稳定参考基因鉴定是植物–病原互作中动态基因表达条件下准确 RT-qPCR 归一化的前提。候选基因基于既往在 Saccharum spp. 杂交种生物与非生物胁迫下的稳定性报道选取，Huang et al. 曾将 ACAD 和 SARMp1 列为甘蔗–S. scitamineum 互作综合排序中最稳定参考基因，而常用 eEF1a 和 CUL 未列最稳定候选，支持需在特定条件下验证。四个早期感染时间点覆盖病原定殖和宿主防御响应激活，转录重编程显著，因此需选择全程稳定表达的参考基因；评估两种 Saccharum 基因型有助于比较黑穗病抗性分子基础。三种互补算法一致将 GAPDH 和 ACAD 列入最稳定参考基因；ACAD 参与脂肪酸β-氧化，GAPDH 为糖酵解关键酶，二者在评估条件下稳定，支持其适用性。传统管家基因 UBQ1（Ubiquitin 1，泛素1）稳定性相对较低，而 UBQ2 高度稳定，提示泛素相关基因受组织、发育阶段和胁迫条件差异调控。Saccharum spp. 的复杂多倍体基因组可能带来转录可塑性和基因型依赖差异，DNA甲基化等机制可能影响候选参考基因稳定性；真菌分离物、接种浓度和取样策略等实验因素也可能导致与既往 NCo376、YC71-374、Vertix 1 和 Vertix 2 等研究排序不同。ScSPL19 分析显示，以 GAPDH/ACAD 归一化时，中等抗性 IACSP02-1064 在24和48 hpi下调，感病 Vertix 10 仅在120 hpi下调，提示 IACSP02-1064 中 ScSPL19 表达调控更早；原文指出 SPL 蛋白参与植物发育过程调控，该早期抑制与病原挑战后发育程序调控的关联尚待实验验证。以最不稳定组合归一化会改变 ScSPL19 差异检测，强化参考基因验证必要性。研究结论部分翻译：总体而言，研究人员的这些结果表明，参考基因验证对于甘蔗–黑穗病病理系统中可靠的 RT-qPCR 归一化至关重要，尤其是在不同基因型和感染阶段之间。ACAD/GAPDH 组合在 IACSP02-1064 和 Vertix 10 中均属于最稳定参考基因之列，支持其在所评估条件下用于归一化的适用性。利用 ScSPL19 对参考基因排序进行评价进一步表明，参考基因选择可显著影响对 S. scitamineum 感染相关基因型和时间依赖性转录响应的检测与解释。通过鉴定甘蔗和能源甘蔗芽组织在早期感染阶段适用的参考基因组合，本研究为准确的相对基因表达分析以及研究基因型特异性黑穗病感染响应提供了基础。这些发现为所评估的 S. scitamineum 感染条件下 Saccharum 芽组织中的 RT-qPCR 归一化提供了有用框架。
