《Molecules》：Oxidative Stress Biomarkers and Senescence-Related Gene Expression in Human Lumbar Degenerative Disc Disease
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背景： 氧化应激日益被认为是腰椎退行性椎间盘疾病（LDDD）的关键驱动因素，可促进炎症、细胞外基质降解和细胞衰老。然而，将人椎间盘组织中的氧化应激生物标志物与衰老相关基因表达相结合的研究仍然有限。方法： 本研究前瞻性纳入32例接受腰椎手术的患者，共获取36个手
背景： 氧化应激日益被认为是腰椎退行性椎间盘疾病（LDDD）的关键驱动因素，可促进炎症、细胞外基质降解和细胞衰老。然而，将人椎间盘组织中的氧化应激生物标志物与衰老相关基因表达相结合的研究仍然有限。方法： 本研究前瞻性纳入32例接受腰椎手术的患者，共获取36个手术获得的椎间盘标本。30例有症状的LDDD患者构成研究人群，而2例PfirrmannⅠ级椎间盘患者仅作为实验室对照。标本被分为轻度退变（PfirrmannⅡ–Ⅲ级）或重度退变（Ⅳ–Ⅴ级）。由于组织可用性限制，RT-qPCR分析在34个标本上进行，而氧化应激生物标志物在32个标本中评估。氧化应激通过测定巯基蛋白水平和一氧化氮产生量来评估，同时采用RT-qPCR定量NF-κB、GSK3β和P21的表达。结果： 重度退变椎间盘的巯基蛋白水平显著低于轻度退变椎间盘（p = 0.009），表明抗氧化防御功能受损。重度退变组的P21 ΔCq值显著更高，表明其相对P21表达水平更低（p = 0.038），而NF-κB和GSK3β在退变组间无显著差异。NF-κB、GSK3β和P21之间存在显著正相关，提示这些分子通路呈协调性变化。一氧化氮水平在重度退变中趋于升高，但差异未达统计学显著。结论： 晚期LDDD与抗氧化能力受损及P21相对表达降低相关。巯基蛋白水平降低和P21表达改变支持氧化应激、衰老相关通路与椎间盘退变之间的关联。
论文解读
一、研究背景与目的
腰椎退行性椎间盘疾病（LDDD）是全球慢性腰背痛和残疾的主要原因之一。根据2021年全球疾病负担研究，腰背痛影响全球约6.19亿人，预计到2050年将增至8.43亿。LDDD被公认为由衰老、遗传易感性、机械负荷和生化改变等多因素相互作用导致的多因素疾病，这些因素逐步损害椎间盘稳态。
氧化应激已被确定是椎间盘退变的关键生物学机制之一。当活性氧（ROS）的产生超过组织抗氧化能力时，这种失衡会促进线粒体功能障碍、氧化性DNA损伤、细胞外基质降解和炎症信号通路激活，最终加速椎间盘退变。抗氧化防御系统包括酶类抗氧化剂（如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶）和非酶类抗氧化分子（如谷胱甘肽和含巯基化合物）。这些防御机制的进行性损害会导致持续性氧化应激。
氧化应激同时也是细胞衰老的重要触发因素。持续性氧化DNA损伤激活细胞周期调控通路，特别是p53–P21轴，导致不可逆的生长停滞和衰老相关分泌表型（SASP）的发展。既往研究已在退变的人椎间盘组织中证实p53、P21和Rb等衰老相关标志物表达增加。
尽管实验模型已大大推进了对椎间盘退变过程中氧化应激的理解，但同时评估手术获得的人椎间盘组织中生化氧化应激生物标志物与衰老相关基因表达的研究仍然稀缺。因此，本研究旨在通过结合巯基蛋白水平和一氧化氮产生的生化评估，以及采用RT-qPCR评估衰老相关基因（NF-κB、GSK3β和P21）的表达，来研究人腰椎退行性椎间盘疾病中的氧化应激。研究人员假设晚期椎间盘退变与抗氧化防御受损及炎症和细胞衰老相关基因表达改变相关。
二、主要技术方法
本研究采用以下关键技术方法：前瞻性纳入32例接受腰椎手术的患者，其中30例有症状的LDDD患者构成研究人群，2例PfirrmannⅠ级椎间盘患者仅作为实验室对照。共收集36个手术获得的椎间盘标本，每个标本独立按照Pfirrmann分级系统分类。由于组织可用性差异，RT-qPCR分析在34个标本（6例轻度、28例重度退变）上进行，氧化应激生物标志物在32个标本（16例轻度、16例重度退变）中评估。椎间盘标本被视为实验单元。主要技术包括：采用RT-qPCR定量NF-κB、GSK3β和P21基因表达，以ACTB（β-肌动蛋白）为内参，使用ΔCq值进行统计分析；通过Griess试剂法测定一氧化氮（NO）产生量；采用DTNB（5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)）法测定巯基蛋白水平。统计学分析使用IBM SPSS Statistics 27，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），相关性分析采用Pearson相关系数并辅以Spearman秩相关验证。
三、研究结果
3.1 研究人群的临床特征
32例接受腰椎退行性疾病手术治疗的患者被前瞻性纳入。30例有症状的LDDD患者构成研究人群并纳入临床和统计分析，2例PfirrmannⅠ级椎间盘患者仅作为实验室对照。共收集36个手术获得的椎间盘标本，其中4例患者贡献了两个腰椎节段的标本。RT-qPCR分析在34个标本上进行，氧化应激生物标志物在32个标本中评估。
3.2 衰老相关基因表达
为研究椎间盘退变严重程度与衰老相关分子通路改变之间的关系，研究人员采用RT-qPCR定量了NF-κB、GSK3β和P21的表达。重度退变椎间盘（PfirrmannⅣ–Ⅴ级）的P21 ΔCq值显著高于轻度退变椎间盘（Ⅱ–Ⅲ级）（6.24 ± 4.25 vs. 2.35 ± 2.20；p = 0.038），表明重度退变组P21相对表达水平更低。NF-κB和GSK3β的ΔCq值在退变组间无统计学显著差异。
3.3 衰老相关基因间的相关性
Pearson相关分析显示所有评估基因之间存在显著正相关。NF-κB与P21之间的相关性最强（r = 0.790，p < 0.001），其次是GSK3β与P21（r = 0.570，p < 0.001）以及NF-κB与GSK3β（r = 0.550，p = 0.001）。这些发现表明腰椎间盘退变过程中所评估的分子通路呈协调性变化。
3.4 氧化应激生物标志物的生化评估
氧化应激通过巯基蛋白水平和一氧化氮产生的定量来评估。轻度退变椎间盘的巯基蛋白水平显著高于重度退变椎间盘（14.42 ± 6.37 vs. 7.52 ± 3.26；p = 0.009），表明晚期退变阶段抗氧化能力降低。重度退变椎间盘的一氧化氮产生趋于高于轻度退变椎间盘（9.29 ± 2.55 vs. 8.02 ± 0.92），但差异未达统计学显著（p = 0.290）。
四、讨论与结论
本研究是少数同时评估手术获得的人椎间盘组织中氧化应激生物标志物与衰老相关分子通路的研究之一。三个主要发现：第一，晚期退变与巯基蛋白水平显著降低相关，表明抗氧化能力受损；第二，重度退变椎间盘P21 ΔCq值显著更高，表明P21相对表达更低，支持与衰老相关分子改变的关联；第三，NF-κB、GSK3β和P21的ΔCq值之间存在显著正相关，表明这些分子通路呈协调性变化而非独立的分子改变。
在所有评估基因中，P21是唯一在轻度和重度退变之间显示统计学显著差异的标志物。P21是p53通路的关键下游效应分子，在细胞应激后的细胞周期停滞和细胞衰老中发挥重要作用。尽管既往研究报道退变椎间盘中P21表达增加，本研究结果在晚期退变中显示不同的表达模式，这种差异可能反映疾病阶段、组织成分、细胞构成或方法学途径的不同。
巯基蛋白水平在重度退变椎间盘中显著降低，表明内源性抗氧化防御进行性受损。含巯基化合物是维持细胞内氧化还原稳态的主要非酶类抗氧化系统之一。一氧化氮在重度退变椎间盘中趋于更高浓度，但未达统计学显著。
本研究的转化意义在于，同时评估生化氧化应激标志物和衰老相关基因表达，比基于单一方法学途径的研究能更全面地描述腰椎间盘退变过程中发生的生物学事件。这些观察支持未来评估抗氧化或衰老调节治疗策略的研究。研究局限性包括样本量相对较小、横断面设计、评估的氧化应激生物标志物有限，以及部分患者贡献多个节段标本可能带来的统计依赖性。
结论： 本研究提供证据表明，晚期腰椎退行性椎间盘疾病与人椎间盘组织中抗氧化能力受损及衰老相关分子通路改变相关。重度退变椎间盘表现出巯基蛋白水平显著降低和P21 ΔCq值显著升高，表明P21相对表达较低。NF-κB、GSK3β和P21的ΔCq值之间的显著正相关进一步表明这些分子通路呈协调性变化。这些发现支持椎间盘退变过程中氧化还原稳态受损与衰老相关分子通路改变之间的关联。生化氧化应激标志物与基因表达的联合评估为疾病严重程度伴随的生物学变化提供了互补信息。需要更大样本量、更多分子标志物和纵向设计的研究来阐明这些发现的生物学意义，并探讨氧化应激和衰老相关通路作为腰椎退行性椎间盘疾病治疗靶点的潜在作用。
