**中文标题：基于历史菌株的分子系统学修订：ACUF收藏库中源自意大利低pH环境的Stichococcus bacillaris（共球藻纲，绿藻门）菌株的分类重估**

《European Journal of Phycology》：ACUF (Algal Collection University Federico II): custodian of microalgae diversity and a valuable resource for research. The case of Stichococcus bacillaris (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) strains isolated from Italian low pH environments 50 years ago

　　

**摘要**

活性培养物收藏库在保存和研究微生物多样性方面发挥着至关重要的作用。ACUF收藏库代表了欧洲长期保存嗜极端环境微藻的宝库之一，本研究所分析的菌株系约50年前从酸性温泉、火山基质和地热栖息地中分离获得，为这种保存方式的科学价值提供了明确例证。从历史分离株中获取新鲜DNA的可能性，使得研究人员能够解答在分离当时无法触及的科学问题。在本研究中，研究人员重新审视了一组最初被鉴定为*Stichococcus bacillaris*的菌株，并展示了现代系统发育学工具如何精炼其分类位置。联合使用*rbcL*基因和核核糖体RNA顺反子（nuclear rRNA cistron）在不同标记间提供了一致的系统发育图景。两个数据集均清晰地将一株菌株（ACUF 104）与其他分离株区分开，并将该菌株归入*Deuterostichococcus*属，具体为*D. epilithicus*。其余九株ACUF菌株则一致地与*Tetratostichococcus jenerensis*聚类。在意大利多个地点发现的*T. jenerensis*样菌株扩展了该谱系已知的生态和地理分布范围。质体与核标记之间的高度一致性支持了修订后系统发育位置的稳健性。同时，TCS分析揭示的谱系结构表明，从不同地热和火山栖息地收集的菌株之间可能发生了微妙的多样化。在两个系统发育树中的独特位置表明，原始的*S. bacillaris*鉴定未能反映其真实的系统发育关系，这很可能归因于仅依赖形态学特征在这类球菌状绿藻中诊断价值有限。

**论文解读：历史极端环境藻类菌株的分子系统学重估——以意大利低pH环境来源的*Stichococcus bacillaris*菌株为例**

**一、研究背景与目的**

活性培养物收藏库在微生物多样性保存和研究中扮演着不可替代的角色。与传统的博物馆标本收藏不同，培养物收藏库维持微生物的存活状态，使得研究人员能够研究其生理学、适应性、遗传变异及潜在应用价值。ACUF（Algal Collection University Federico II）收藏库是欧洲历史最悠久的嗜极端环境微藻收藏库之一，保存着超过1000株微藻，其中包括400余株源自火山土壤、硫磺泉和地热区域等极端环境的菌株。这些菌株多数由Roberto Taddei等研究人员在20世纪70年代采集，当时从生态学角度而言，这些采集活动如今已难以甚至无法重复。因此，这些菌株构成了过去生态系统的窗口，保存了在过去50年间常已发生显著变化的环境中的生物学信息。

*Stichococcus bacillaris* N?geli（共球藻纲，绿藻门）是一个分类学上具有挑战性的类群。这类单细胞绿藻形态简单，其有限的诊断特征长期以来导致物种界限模糊或过于宽泛。近年来的系统学修订研究表明，许多历史上被鉴定为*S. bacillaris*的菌株实际上属于Stichococcaceae科内的不同属，揭示了出乎意料的隐存多样性。本研究的对象为10株源自意大利极端环境、于20世纪70年代由R. Taddei和G. Pinto分离并保存于ACUF收藏库的菌株，它们最初基于形态学和生态生理学特征被鉴定为*S. bacillaris*。

本研究的主要目标包括：（1）利用新获得的分子数据更新先前基于形态学的物种鉴定；（2）评估基于形态学的分类归属与基于核和质体标记的系统发育证据之间的一致性，重新评估这些菌株的分类位置；（3）为50年前从意大利极端环境中分离的单细胞藻类的多样性和演化关系提供新的见解。为实现这些目标，研究人员对质体*rbcL*基因和核SSU-ITS-LSU rRNA顺反子进行了测序，这两种标记已被证明对解析类*Stichococcus*类群具有信息价值。

**二、主要关键技术方法**

研究人员从ACUF收藏库中选取10株历史菌株（表1所列），涵盖意大利中部和南部的酸性硫磺泉、硫磺矿及地热区域。DNA提取采用物理破碎结合商业试剂盒方法，质体标记*rbcL*基因使用PRASF1/ellaR2引物对扩增，核标记SSU-ITS-LSU rRNA顺反子使用EAF3/ITS055R引物对扩增并辅以自行设计的测序引物。系统发育分析采用最大似然法（ML，IQ-TREE）和贝叶斯推断（BI，MrBayes），核苷酸替代模型通过AIC准则在jModelTest中选择。此外，使用TCS软件基于统计简约法构建基因谱系网络，用于解析亲缘关系密切菌株间的细微谱系结构。

**三、研究结果**

**1. DNA条形码分析与数据集特征**

初步BLASTn搜索结果表明，所有菌株均属于Stichococcaceae科。菌株ACUF 104与*Deuterostichococcus epilithicus*具有最高相似性，而其余九株菌株与*Tetratostichococcus jenerensis*（菌株SAG 2138）显示出较高一致性。由于许多GenBank收录序列缺乏整合的分类学验证，BLASTn结果仅作为初步指南，用于构建后续系统发育分析的精选数据集。质体数据集最终包含82个*rbcL*序列（1170个字符位点），核数据集则根据分析区域不同包含32至58个分类单元。

**2. 质体系统发育分析**

基于*rbcL*基因的系统发育分析确定了三种单倍型：单倍型O（仅ACUF 104）、单倍型Y（ACUF 055和146）以及单倍型R（其余七株）。系统发育树中，ACUF 104以强统计支持位于*Deuterostichococcus*群内，与*D. epilithicus*聚为一支；其余九株菌株以两个不同单倍型与*T. jenerensis*（SAG 2138）聚类，支持度同样稳健。此外，分析揭示部分GenBank收录序列可能存在分类鉴定错误，例如某些标注为*Diplosphaera* sp.的序列落入*Deuterostichococcus*群内。

**3. 核基因系统发育分析**

新获得的核序列涵盖近乎完整的SSU区、完整ITS区（ITS1-5.8S-ITS2）及短的LSU片段，序列长度3480-4505 bp，差异主要反映SSU内内含子的存在情况。两个主要内含子区域（B和C）在不同菌株中的分布呈现差异化模式。基于SSU（排除V9高变区）的系统发育树稳健地恢复了Stichococcaceae科内主要谱系，确认了*Deuterostichococcus*、*Tetratostichococcus*、*Diplosphaera*和*Stichococcus* s.s.的界限。两个标记在ACUF菌株的归属上高度一致：ACUF 104位于*Deuterostichococcus*，其余九株位于*Tetratostichococcus*。在ITS和SSU+ITS联合分析中，九株菌株内部获得了轻度增加的解析度，揭示了若干以高支持率恢复的亚谱系。

**4. 统计简约网络分析**

基于SSU-ITS-LSU序列的TCS网络分析显示，两对菌株（ACUF 055/106和ACUF 158/203）共享相同核糖体型。ACUF 055/106占据网络中最中心位置，代表最不衍化的核糖体型，是多条突变路径的起点。ACUF 158/203构成第二个主要谱系中枢，其余菌株由此通过不同长度的突变路径分化。ACUF 149和ACUF 155需要最多的突变步数，是该类群中分歧最大的成员。

**四、讨论与结论**

培养物收藏库是微生物多样性保护和研究的基石资源。ACUF收藏库保存的源自50年前意大利极端环境的菌株构成了珍贵的历史档案，为重新评估基于纯形态学的历史分类鉴定提供了独特材料。本研究证明，曾被归入*S. bacillaris* s.l.的菌株现在可被精准地归入不同属的分支中，为这些地点在20世纪70年代的极端环境藻类多样性提供了更准确的图景。质体和核标记的一致性支持了当前Stichococcaceae科属级分类框架的稳健性。

从生态学角度看，*D. epilithicus*已知偏好岩石和土壤栖息地，但ACUF 104分离自意大利中部酸性硫磺泉（pH 2.5，20°C），提示该物种可能具有此前未记录的生态适应性灵活性。九个意大利菌株与*T. jenerensis*全型株（SAG 2138）形成单系群，扩展了该属已知的生物地理分布范围。与来自海洋沉积物（英国，CCAP 379/5）、酸性泉（意大利，CCAP 379/7）和热带栖息地（哥斯达黎加，FACHB753）的序列共同聚类，凸显了这类形态简化微藻分类学的持续挑战。值得注意的是，Hoda?等人所指的“酸性泉”菌株CCAP 379/7系1976年由R. Taddei在意大利中部Terme dei Gracchi采集，其SSU序列与来自Bellisio Solfare的ACUF 146仅有一个碱基的插入/缺失差异。

TCS网络揭示的谱系结构与菌株分离地点的地质背景部分对应。来自西西里岛两个不同硫磺矿的菌株（ACUF 158和203）共享核糖体型，可能代表一个生物地理学上连贯的西西里谱系。尽管所有九株菌株均源自富硫系统，但涵盖了宽广的pH梯度（1.5-3.5）、温度范围（16-26°C）和不同地质背景。观察到的轻微谱系结构可能暗示对不同酸度条件的适应、在孤立热液系统中的长期持续存在，或意大利硫磺地点间独立的微进化路径，但现有数据尚无法检验这些假说。

SSU内含子分布模式与TCS网络推断的谱系排列存在松散的对应关系：网络外围的菌株（如ACUF 149、155、102、211）倾向于表现出内含子缺失，而中心核糖体型（ACUF 055/106和158/203）保留完整的内含子补体。这一对应关系应谨慎解读，内含子获得或缺失是否与该类群内的微尺度分歧相关尚不清楚。

综上所述，本研究凸显了ACUF等活性藻类收藏库的价值——保存数十年前分离的菌株并允许以现代分子工具重新评估，延续了R. Taddei教授的学术遗产。与*T. jenerensis*相关的独特意大利谱系的发现扩展了该分类单元的已知分布范围，并强调了意大利硫磺环境的生态意义。对国家级培养物收藏库的保存和分子表征至关重要，因为这些收藏库中的菌株不仅是嗜极端环境微藻的分类学和生态学参考材料，也是来自某些已发生显著变化环境的独特基因组资源。