《Bioengineering》：CCL2 Facilitates Osteoclastogenesis and Osteogenesis in Both Young and Aged Female Murine MSC–Macrophage Co-Cultures
编辑推荐：
摘要专业翻译
“炎症性衰老”（Inflammaging）是指随年龄增长而持续存在的全身性低水平慢性炎症状态，其可损害骨愈合。C-C基序趋化因子配体2（CCL2）在急性炎症期间促进巨噬细胞迁移，并随后介导巨噬细胞与间充质干细胞（MSC）之间的相互作用。研究人员假
摘要专业翻译
“炎症性衰老”（Inflammaging）是指随年龄增长而持续存在的全身性低水平慢性炎症状态，其可损害骨愈合。C-C基序趋化因子配体2（CCL2）在急性炎症期间促进巨噬细胞迁移，并随后介导巨噬细胞与间充质干细胞（MSC）之间的相互作用。研究人员假设CCL2可在年轻及年老的鼠原代细胞中增强骨再生，并研究了CCL2对成骨和破骨细胞生成的影响。在以下实验中，研究人员使用了10–12周龄和15–17月龄的雌性小鼠。在成骨分化实验中，研究人员分离MSCs和未定向分化的初始巨噬细胞（M0）并共培养，以研究CCL2对细胞间相互作用、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色的影响。在破骨细胞生成分化实验中，研究人员分离并培养原代骨髓细胞，随后进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和组织蛋白酶K染色以及实时定量RT-PCR。在CCL2处理组中，细胞在初始24小时内与重组CCL2共培养。来自年轻小鼠的MSCs表现出比年老小鼠更强的成骨能力。CCL2处理组在年轻和年老细胞中均表现出更大的茜素红阳性区域。在破骨细胞生成分化实验中，CCL2处理组在年轻和年老细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性细胞数量以及C-fos和Dc-stamp的表达水平均有所增加。这些发现表明，CCL2在年轻和年老的鼠原代细胞中均能促进成骨，特别是矿化作用，并增强特定的破骨细胞生成特征。这些效应提示CCL2可能在骨重塑中具有潜在作用，包括在衰老背景下的骨重塑。
论文解读文章
一、研究背景与目的
随着全球人口老龄化进程的加速，骨质疏松症及其相关的脆性骨折发病率持续攀升，严重影响患者的生活质量并加重医疗负担。骨再生的核心在于骨吸收与骨形成之间的动态平衡，而衰老过程中这一平衡被打破，导致骨量显著下降、骨骼成分变得更为脆弱。衰老伴随着一种被称为“炎症性衰老”（Inflammaging）的持续性全身低水平慢性炎症状态，这种无明显感染或其他特定病因的慢性炎症虽不同于急性炎症反应，却会损害老年人的骨再生能力，增加年龄相关骨骼疾病和功能衰退的风险。急性炎症反应对于启动骨修复过程至关重要，因此适当调控急性炎症反应被视为改善老年人骨再生的潜在治疗靶点。
C-C基序趋化因子配体2（CCL2）是一种炎症性趋化因子，在炎症过程中与巨噬细胞和间充质干细胞（MSC）的迁移密切相关。CCL2是衰老细胞衰老相关分泌表型（SASP）中常见分泌的促炎介质，通过与C-C基序趋化因子受体2（CCR2）结合诱导趋化活性并增加钙内流。已有研究显示，CCL2在骨微环境中的表达受RANKL、甲状旁腺激素（PTH）/甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）等多种因素调控，且CCL2对破骨前体细胞的迁移、破骨细胞的形成和活性具有重要调节作用。然而，CCL2在衰老背景下对骨重塑相关细胞过程的综合影响，尤其是对年轻与年老细胞中成骨和破骨细胞生成的差异效应，尚缺乏系统研究。基于此，研究人员假设CCL2可能在年轻及衰老细胞中均促进骨再生，并设计了本实验加以验证。
二、研究设计与主要技术方法
本研究使用10–12周龄和15–17月龄的BALB/c雌性小鼠（购自Jackson Laboratory），分别代表年轻和年老组。研究采用的主要技术方法包括：从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓来源的间充质干细胞（MSC）和骨髓来源的巨噬细胞；通过流式细胞术鉴定MSC表型（Sca1+/CD105+/CD44+/CD45-/CD34-/CD11b-）；使用L929白细胞适应培养基和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导获得初始巨噬细胞（M0）；进行MSC单培养及MSC与巨噬细胞直接共培养（1:1比例）；采用alamarBlue细胞活力试剂评估细胞活力；通过碱性磷酸酶（ALP）染色（第7天）和茜素红染色（第21天）评估成骨分化；通过免疫荧光染色鉴定巨噬细胞表型（M1：iNOS/CD11b双阳性；M2：Arg1/CD11b双阳性）；通过TRAP染色、组织蛋白酶K检测及实时定量RT-PCR评估破骨细胞生成分化；统计分析采用Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较。
三、研究结果
3.1 细胞活力不受CCL2刺激影响
研究人员在成骨和破骨细胞生成分化过程中，使用alamarBlue细胞活力试剂对年轻和年老MSCs进行了细胞活力检测。结果显示，在两种分化过程中，CCL2处理组与未处理组的细胞活力均无显著差异，表明CCL2对细胞活力无不良影响。
3.2 CCL2在年轻和年老细胞的MSC-巨噬细胞共培养中增强矿化作用
在MSC单培养中，年轻鼠细胞表现出比年老细胞更大的ALP阳性面积（p < 0.01），但recCCL2处理组与未处理组之间无显著差异；茜素红染色结果趋势相似。这表明CCL2在MSC单培养中对成骨无直接作用。在MSC与巨噬细胞共培养中，年轻鼠MSC的成骨能力高于年老鼠（p < 0.01）；recCCL2处理组在年轻（p < 0.05）和年老（p < 0.05）细胞中均表现出更大的茜素红阳性面积，但ALP染色无显著差异。这说明CCL2在共培养条件下可增强矿化作用，但未显著影响早期成骨标志物ALP。
3.3 CCL2在成骨分化第7天增加M1比例并降低M2比例
免疫荧光染色结果显示，在CCL2未处理组中，年老细胞比年轻细胞具有更高的M1比例（p < 0.001）和更低的M2比例（p < 0.01）；CCL2处理组中趋势相同（M1：p < 0.01，M2：p < 0.05）。CCL2在年轻和年老细胞中均增加了M1/M0比例（年轻：p < 0.001；年老：p < 0.01）并降低了M2/M0比例（年轻：p < 0.01；年老：p < 0.05）。这表明CCL2可促进巨噬细胞向促炎性M1表型极化，并抑制抗炎性M2表型。
3.4 CCL2在年轻和年老细胞中均增加TRAP阳性细胞数量及C-fos和Dc-stamp表达水平
在破骨细胞生成分化实验中，recCCL2处理组在年轻（p < 0.05）和年老（p < 0.01）细胞中的TRAP阳性细胞数量均显著增加，但组织蛋白酶K阳性细胞数量无显著差异。RT-PCR结果显示，CCL2处理在年轻（C-fos：p < 0.001；Dc-stamp：p < 0.01）和年老（C-fos：p < 0.01；Dc-stamp：p < 0.05）细胞中均增加了C-fos和Dc-stamp的表达水平。年轻细胞在CCL2未处理（p < 0.05）和处理（p < 0.01）条件下均表现出比年老细胞更高的Dc-stamp表达水平。Nfatc1表达无显著变化。
四、讨论与结论
研究讨论部分指出，CCL2在MSC-巨噬细胞共培养中促进成骨矿化，但在MSC单培养中无此效应，提示CCL2的作用依赖于巨噬细胞的存在及其表型变化。CCL2通过p38 MAPK和NF-κB等信号通路促进M1巨噬细胞极化，可能部分解释了本研究中观察到的巨噬细胞表型变化。在破骨细胞生成方面，CCL2可能增强单核系破骨前体细胞的募集和活化并促进细胞融合，与C-fos、Dc-stamp和TRAP阳性细胞增加一致；而Nfatc1表达和组织蛋白酶K阳性细胞无显著增加，提示该效应可能更集中于前体细胞活化和融合阶段，而非终末破骨细胞成熟和功能活化。Dc-stamp作为细胞融合和破骨细胞生成的关键调控因子，在年轻细胞中表达更高，可能是研究年龄相关骨再生变化的潜在靶点。
研究结论部分翻译：总之，研究人员阐明了CCL2在年轻和年老细胞中均能促进成骨，特别是矿化作用，并增强特定的破骨细胞生成特征。这些发现提示CCL2可能在衰老背景下的骨重塑中具有潜在作用。
