《Bioengineering》：Hemolysis During Ex Vivo Lung Perfusion Is Associated with Endothelial Injury, Cytokine Release, and Primary Graft Dysfunction
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原发性移植物功能障碍（primary graft dysfunction, PGD）是肺移植后早期发病和死亡的主要原因。在基于血液的离体肺灌注（ex vivo lung perfusion, EVLP）过程中，溶血会释放血浆游离血红蛋白（plasma-free
原发性移植物功能障碍（primary graft dysfunction, PGD）是肺移植后早期发病和死亡的主要原因。在基于血液的离体肺灌注（ex vivo lung perfusion, EVLP）过程中，溶血会释放血浆游离血红蛋白（plasma-free hemoglobin, pfHb）及其他红细胞源性产物，可能促进内皮损伤和炎症反应。研究人员探究了EVLP相关溶血是否与细胞因子释放、内皮功能障碍及3级PGD（PGD3）相关。在这项前瞻性、单中心观察性研究中，分析了来自57例接受Organ Care System Lung支持的双肺移植受者的EVLP结束时的灌流液中的pfHb、26种细胞因子、血细胞计数，以及与移植后72小时内发生PGD3的关联。采用模拟EVLP血液回路模型评估红细胞储存时间和回路运行时间对溶血的影响。将产生的溶血性灌流液作用于人肺微血管内皮细胞，以评估屏障损伤和炎症激活。在57例受者中，32例（56.1%）在移植后72小时内任一时刻发展为PGD3。较高的EVLP结束时pfHb、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）水平与PGD3相关，且pfHb与IL-6和IL-8呈正相关。溶血随血液储存时间和EVLP时间的延长而增加，其中储存时间是血液回路模型中溶血的主要贡献因素。溶血性灌流液破坏了内皮连接，增加了通透性，并诱导了IL-6和IL-8的释放。EVLP相关溶血与肺移植后内皮屏障损伤、炎症激活及PGD3有关。通过改进血液制品选择和EVLP回路管理来减少溶血，可能是一种改善移植后结局的可调控策略。
研究背景与目的
原发性移植物功能障碍（PGD）是肺移植后早期发病和死亡的主要原因。离体肺灌注（EVLP）技术允许供体肺在常温、通气和灌注条件下重新评估，扩大了边缘供体的使用范围。然而，EVLP相关的生物学损伤，尤其是在基于血液或长时间灌注的情况下，可能会增加PGD的风险。在EVLP过程中，红细胞暴露于超生理剪切力和湍流、人工氧合器表面的停滞和再循环等因素，可能导致溶血。溶血释放的血浆游离血红蛋白（pfHb）、血红素和铁能够促进一氧化氮清除、氧化应激、内皮激活、血管收缩和微血管屏障功能障碍，这些机制在肺循环中尤为重要，因为内皮损伤和通透性增加是水肿形成、缺血再灌注损伤和PGD的核心环节。此外，溶血还可能放大炎症信号，例如pfHb与血栓性炎症及白细胞介素（IL）-6和IL-8等细胞因子的释放有关。尽管溶血、内皮损伤和炎症激活各自均与肺损伤有关，但它们在临床EVLP过程中的相互关系及其与后续PGD的关联尚不完全清楚。因此，研究人员开展了一项转化研究，旨在检验以下假设：（1）EVLP结束时较高的pfHb和炎性细胞因子与移植后72小时内发生的3级PGD（PGD3）相关；（2）储存时间较长的血液会增加EVLP相关溶血的易感性；（3）溶血性灌流液通过破坏血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）连接、增加通透性和诱导IL-6/IL-8释放，直接损伤肺微血管内皮。
研究方法
本研究结合了临床EVLP灌流液生物标志物分析、模拟EVLP血液回路模型以及体外细胞实验。临床部分为一项前瞻性、单中心观察性研究，纳入2018年3月11日至2023年12月6日期间在贝勒圣卢克医疗中心（Baylor St. Luke’s Medical Center）接受双肺移植的57例受者，收集EVLP结束时的灌流液用于检测。关键技术方法包括：使用Bio-Plex Pro? Human Cytokine 27-plex Assay多重检测26种细胞因子浓度；采用Harboe法测定pfHb；构建标准化体外血液回路模型，使用CentriMag离心泵在EVLP样条件下（37°C、pH 7.4、流速2.5 L/min）独立评估血液储存时间（1、3、5周）和回路运行时间（24小时）对溶血的影响；将人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）暴露于溶血性灌流液或血红素，通过免疫荧光评估VE-cadherin连接完整性，通过异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖70跨膜转运测量内皮通透性，并使用多重免疫分析法检测细胞培养上清液中IL-6和IL-8的释放。
研究结果
3.1 按PGD3状态分层的临床结局：在57例双肺移植受者中，32例（56.1%）在移植后72小时内发生PGD3。尽管受者和供者基线特征相似，但发生PGD3的受者术后早期结局更差，包括更长的住院时间（中位29天 vs. 19天；p=0.013）、通气时间≥5天（69% vs. 28%；p<0.001）、气管切开率更高（53% vs. 20%；p=0.011），以及1年死亡率更高（25% vs. 0%；p=0.007）。
3.2 EVLP结束时的pfHb和炎性生物标志物与PGD3相关：通过对EVLP结束时灌流液中pfHb和26种细胞因子的分析，经批次校正和多重检验调整后，pfHb、IL-6和IL-8是唯一与移植后72小时内PGD3显著相关的生物标志物（错误发现率<0.25）。发生PGD3的受者其EVLP结束时pfHb、IL-6和IL-8水平均高于未发生PGD3的受者。相关性分析显示，pfHb与IL-8（Spearman r=0.42；p=0.001）和IL-6（Spearman r=0.37；p=0.005）呈正相关。相比之下，全血细胞计数参数在两组间无显著差异。
3.3 较长的血液储存时间和EVLP时间与临床EVLP中更高的溶血程度相关：在临床EVLP队列中，灌流液pfHb水平随着红细胞储存时间的延长而升高，当灌流液使用储存>31天的血液制备时，pfHb显著高于储存<14天的血液（p=0.006）。同样，pfHb浓度也随EVLP时间的延长而增加，灌注>12小时的肺脏其pfHb水平显著高于灌注<6小时（p=0.002）或6-12小时（p=0.001）的肺脏。
3.4 在受控的EVLP样条件下，血液储存时间是溶血的主要决定因素：在标准化的体外血液回路模型中，经过24小时灌注，溶血程度因血液储存时间不同而有显著差异（p=0.004），而单独回路运行时间的影响未达到统计学显著性（p=0.067）。储存5周的血液在整个实验过程中产生的pfHb水平始终高于储存1周和3周的血液，表明储存时间较长的血液在EVLP样条件下更容易受到机械损伤。相反，回路运行时间对代谢参数影响更大，乳酸积累随储存时间和灌注时间的延长而增加。
3.5 溶血性灌流液诱导内皮损伤和炎症激活：将HLMVECs暴露于溶血性灌流液后，观察到进行性的形态学改变，包括细胞应激、形态改变、细胞间隙增大和深色胞质颗粒积聚。VE-cadherin染色显示，对照细胞具有连续的连接性VE-cadherin，而血红素和溶血性灌流液处理减少了膜相关染色并增加了细胞-细胞连接的不连续性，高溶血条件下的破坏最为严重。功能上，溶血性暴露以剂量依赖性方式加速了FITC-葡聚糖跨内皮单层的转移。此外，溶血性灌流液还诱导了强烈的内皮炎症激活，低溶血组IL-8浓度升至8842±461 pg/mL，高溶血组升至31524±2644 pg/mL，高溶血条件下IL-6升至1401±360 pg/mL。而在无内皮细胞的体外血液回路血浆中未检测到IL-6和IL-8，支持内皮细胞是溶血诱导细胞因子产生的来源。
讨论与结论
本转化研究确定了EVLP相关溶血是内皮损伤、炎症激活和肺移植后PGD3的潜在促成因素。研究结果表明，EVLP提供了一个在植入前评估移植物损伤的独特窗口，此时损伤过程可能仍是可调控的。灌流液中的pfHb、IL-6和IL-8可作为移植物损伤的标志物、EVLP过程质量的指标以及减少下游移植物功能障碍的潜在治疗靶点。研究强调了血液相容性在EVLP平台设计中的重要性。血液储存时间被确定为一种潜在可调控的溶血促成因素，在临床队列中，储存>31天的血液和超过12小时的EVLP时间与更高的溶血相关；在受控的血液回路模型中，储存时间是pfHb累积的主导因素，而24小时的回路运行时间效应较弱。这与红细胞储存损伤（包括变形能力降低、膜脆性增加、电解质变化和代谢恶化）一致。值得注意的是，尽管PGD组和非PGD组之间的溶血存在显著差异，但EVLP结束时灌流液的总血红蛋白浓度和血细胞比容仍具可比性，这表明即使轻微的红细胞膜破坏也能显著增加pfHb水平而不引起总红细胞质量的明显变化。研究提出了几种减少溶血相关EVLP损伤的策略，包括优先使用新鲜血液、持续监测pfHb和灌流液化学指标、改善回路血液相容性以及保护内皮的疗法。
研究结论：EVLP结束时的溶血，连同升高的IL-6和IL-8，与PGD3和较差的移植后结局相关。溶血性灌流液直接破坏了肺微血管内皮连接，增加了通透性，并诱导了炎性细胞因子的释放。长时间的血液储存是EVLP样条件下溶血的主要促成因素。这些发现支持进一步研究血液储存实践、血液相容性回路设计和实时溶血监测，作为减少EVLP相关损伤和改善移植后结局的潜在策略。
