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比色技术及其相关染料，相较于荧光和发光类方法，可为许多筛选应用提供更低成本且更易获取的替代方案。在此，研究人员旨在识别适用于推定蛋白质-配体结合分析测定的比色染料，重点关注那些常难以用标准生物物理方法研究的高构象动态蛋白质。研究人员从23种市售比色染料中筛选出
比色技术及其相关染料，相较于荧光和发光类方法，可为许多筛选应用提供更低成本且更易获取的替代方案。在此，研究人员旨在识别适用于推定蛋白质-配体结合分析测定的比色染料，重点关注那些常难以用标准生物物理方法研究的高构象动态蛋白质。研究人员从23种市售比色染料中筛选出3种候选染料，它们在两种结构不同的目标蛋白质Med25 AcID和CBP KIX存在时表现出浓度依赖性吸光度变化。对蛋白质-配体结合事件的后续研究将焦点缩小至赤藓红B（erythrosin B），它是Med25和CBP与现有小分子配体结合事件中最灵敏的报告染料。值得注意的是，Med25–降冰片酸（norstictic acid）和CBP–藤黄酸（garcinolic acid）复合物的结合数据呈现出聚类模式，与通过正交方法测得的各复合物热稳定性数据一致。因此，赤藓红B等比色染料可作为高价值蛋白质靶标（包括具有高度构象可塑性的蛋白质）推定筛选分析中更广泛可及的工具。
论文解读
一、研究背景与问题
真核生物蛋白质组中超过50%的蛋白质含有 intrinsically disordered regions（IDRs，固有无序区域），这些蛋白质在构象上是动态的。从转录到蛋白质折叠，构象流动性是功能的内在属性，这类蛋白质在病理状态中的普遍存在使其成为重要的研究和靶向对象。例如，在BRAFV600E驱动的黑色素瘤中，富含IDR且构象动态的ETV5-Med25复合物的失控形成是侵袭性疾病的基础，使其成为有吸引力的治疗靶点，但相关研究进展缓慢。动态蛋白质如ETV5和Med25通常特别难以研究和靶向，因为许多常用的生物物理和生化分析方法是为具有稳定三维结构的蛋白质开发的。
荧光染料在经典和动态蛋白质分析中是有价值的试剂。例如，在差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry，DSF）中，环境敏感荧光染料SYPRO orange在热诱导蛋白质去折叠时信号强度的变化可快速测量蛋白质在有无结合伴侣情况下的稳定性。研究人员注意到SYPRO orange及相关荧光染料与比色染料在结构上的相似性。这些比色染料在临床诊断、环境监测、食品安全、研究诊断和法医筛查等应用中，是低成本、快速、灵敏分析的高效试剂。在许多情况下，与生物分子（包括蛋白质）的结合是比色染料在这些应用中使用的内在属性。研究人员假设，以这类染料为特征的比色分析可以提供一种更易获取的策略，用于对构象动态蛋白质与潜在结合伴侣进行初步筛选。
为验证这一假设，研究人员选择了两种能代表动态蛋白质挑战与机遇的蛋白质基序作为靶标：Med25 AcID和CBP KIX。尽管结构不同，Med25 AcID和CBP KIX在转录起始过程中与无序转录因子基序结合，且常在疾病中失调。两种蛋白质都表现出相当大的构象可塑性，并以中等亲和力与转录因子和小分子相互作用。因此，许多常见的蛋白质结合相互作用推定分析方法对Med25 AcID和CBP KIX无效或难以适用。
二、研究内容与结论概述
研究人员在此报告，低成本、市售的比色染料赤藓红B可作为推定分析中这两种动态蛋白质特异性结合相互作用的准确报告染料。所得吸光度分析成本低廉且兼容微板读取器，无需专用荧光仪器即可快速指示动态蛋白质相互作用。该研究的意义在于，比色染料如赤藓红B可作为高价值蛋白质靶标（包括具有高度构象可塑性的蛋白质）推定筛选分析中更广泛可及的工具，为蛋白质结合事件研究提供了更经济、更易获取的途径。
三、主要关键技术方法
研究人员首先测量了23种市售比色染料在CBP KIX和Med25 AcID浓度递增条件下的吸光度光谱，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）评估染料区分不同蛋白质条件的能力，并以轮廓系数（silhouette score）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）作为聚类质量和组间差异的验证指标。随后在蛋白质-配体结合分析中，固定蛋白质（32 μM）和赤藓红B（10 μM）浓度，递增小分子配体当量，通过PCA评估吸光度数据的剂量依赖性聚类模式。平行采用差示扫描荧光法（DSF），以SYPRO orange为荧光染料，在实时定量PCR仪器上获取熔解曲线并计算熔解温度变化（ΔTm）作为正交验证。所有光谱数据均使用GraphPad Prism 10绘制，PCA分析使用Python 3.12完成，统计验证使用标准R包进行。
四、研究结果
候选染料的筛选与鉴定。 研究人员从23种结构多样的市售染料阵列中，通过测量染料在CBP KIX和Med25 AcID浓度递增下的吸光度光谱，筛选出赤藓红B、溴百里酚蓝（bromothymol blue）和快绿FCF（fast green FCF）三种候选染料，它们表现出可重现的、对CBP KIX和Med25 AcID具有区分性的蛋白质浓度依赖性光谱变化。赤藓红B在蛋白质存在时产生5 nm的λmax位移并伴随峰强度小幅下降，与先前研究中观察到的赤藓红B-蛋白质结合的红移和减色效应一致。溴百里酚蓝在任一蛋白质存在时表现出全光谱减色效应，且与Med25 AcID结合时出现小幅红移。快绿FCF在吸收峰边缘显示微小位移。对照染料甲基橙（methyl orange）对两种蛋白质的区分能力极小。通过PCA分析，赤藓红B对CBP KIX和Med25 AcID的每种条件均产生离散聚类，因此被选为进一步研究的候选染料。
蛋白质浓度依赖的赤藓红B光谱响应。 研究人员在蛋白质浓度最高32 μM范围内以四重复测试赤藓红B光谱变化，整个浓度范围内未观察到蛋白质沉淀或聚集。PCA评估显示，CBP KIX和Med25 AcID均存在蛋白质浓度依赖性光谱响应。对于CBP KIX，赤藓红B在每个浓度下产生不同聚类，轮廓系数为0.231表明个体观测值分离不完全，但MANOVA结果表明样本组具有不同且显著的多变量光谱特征。对于Med25 AcID，所有浓度下的光谱响应均与仅染料对照不同，但8 μM和32 μM数据重叠，表明较高蛋白质浓度下信号饱和。
赤藓红B比色分析检测小分子结合。 研究人员使用已知配体藤黄酸（garcinolic acid，GA）与CBP KIX（KD = 1 μM）以及降冰片酸（norstictic acid，NA）与Med25 AcID（IC50 = 4 μM）的配对进行推定结合分析。在固定蛋白质（32 μM）和赤藓红B（10 μM）条件下递增配体当量，PCA显示CBP KIX•GA复合物的聚类具有高组内相似性和强组间分离（轮廓系数0.818），Med25 AcID•NA复合物也呈现剂量依赖性变化（轮廓系数0.316），MANOVA均确认样本身份对多变量PCA分数有统计显著影响。两种蛋白质均在单一当量配体时观察到明显变化，且具有清晰剂量依赖性。
与DSF结果的一致性。 平行DSF实验显示，降冰片酸和藤黄酸分别以剂量依赖性方式改变其靶蛋白的热稳定性。赤藓红B比色分析结果与更成熟的DSF分析结果类似，证实了该比色方法作为推定筛选工具的有效性。
五、讨论与结论
赤藓红B比色分析是一种推定测试，适用于提供值得进一步研究的蛋白质-配体结合相互作用的初始信号。赤藓红B成本约150美元/100 g，而SYPRO orange约300美元/500 mL；所需紫外分析仪器在环境温度下运行，成本通常低于需要变温控制的荧光分析仪器。便携式紫外-可见96孔板读取器价格不到5000美元，而DSF常用的台式实时定量PCR仪器价格在10,000至30,000美元之间。因此，使用比色染料进行蛋白质表征和/或筛选为DSF等技术提供了可获取的替代方案，降低了进入稳健分析工作流程的门槛，有助于分析人员确定哪些配体值得推进、哪些应分流，从而节约资源。
研究结论：利用吸光度光谱数据，研究人员评估了现成比色染料作为Med25 AcID和CBP KIX配体结合事件报告染料的可行性。在三种鉴定出的染料中，赤藓红B对蛋白质靶标表现出多功能性，并能检测配体诱导的稳定化。此外，该比色染料被证明是比更成熟的DSF技术更低成本的分析工作流程切入点。该分析方法目前仅在两种动态蛋白质上得到验证，其更广泛适用性尚待确定；分析格式针对高纯度分离蛋白设计，目前形式可能不适用于复杂裂解液或类似异质环境。未来，更广泛的筛选活动以识别具有更强光谱响应的比色染料（单独或作为阵列）将把该方法的应用范围扩展到推定应用之外。
