小鼠Schlafen家族蛋白通过mSlfn2与mSlfn8限制γ疱疹病毒MHV68在成纤维细胞中的复制

《Pathogens》：Mouse Schlafen Family Proteins Control MHV68 Replication in Fibroblasts

　　

Schlafen蛋白是一类干扰素（interferon, IFN）应答调节因子，参与细胞和抗病毒通路调控，能深刻影响病毒复制与宿主防御。已知多种病毒感染可诱导人类细胞中Schlafen家族成员表达，而小鼠体内的感染研究主要局限于mSlfn2——一种在人类中缺少明确直系同源物的I组Schlafen蛋白。对三种不同感染模型的RNA测序（RNA-seq）分析显示，小鼠Schlafen蛋白可响应鼠γ疱疹病毒68（murine gammaherpesvirus 68, MHV68）感染而在成纤维细胞、B细胞和原代腹腔巨噬细胞中被诱导。值得注意的是，mSlfn8在多轮低感染复数（multiplicity of infection, MOI）感染条件下被诱导，而较高病毒接种量启动的感染则无法诱导mSlfn8表达。为评估mSlfn8或相关Slfn是否影响MHV68复制，研究人员在NIH 3T3细胞中开展了小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）介导的敲降和CRISPR/Cas9介导的mSlfn2、mSlfn8、mSlfn9敲除。两个独立的mSlfn2敲除克隆细胞系和两个独立的mSlfn8敲除克隆细胞系均支持更高的病毒滴度，表明这些mSlfn是MHV68在鼠成纤维细胞中复制的限制因子。综上，这些结果表明mSlfn2和mSlfn8在MHV68感染中发挥抗病毒效应因子功能，并支持MHV68通过拮抗干扰素诱导的小鼠Schlafen表达以促进高效复制的模型。

研究背景：Schlafen蛋白家族是一类脊椎动物特异性的干扰素（interferon, IFN）应答调节因子，参与病毒感染、细胞周期阻滞和DNA损伤等细胞过程的调控。人类编码6种Schlafen蛋白（hSLFN），小鼠编码9种（mSlfn），依据结构可分为I、II、III组。已有研究显示hSLFN5、hSLFN11、hSLFN12和hSLFN14对多种疱疹病毒具有抗病毒活性，但小鼠中除mSlfn2外，哪些Slfn成员参与疱疹病毒限制尚不清楚；mSlfn2属于I组且与人SLFN无明确直系同源。mSlfn8与已知抗病毒蛋白hSLFN11和hSLFN13在氨基酸序列上高度相似，但其在γ疱疹病毒感染中的功能未见报道。鼠γ疱疹病毒68（murine gammaherpesvirus 68, MHV68）是与人类卡波西肉瘤相关疱疹病毒和EB病毒相关的小鼠感染模型。为此，研究人员系统分析了mSlfn在MHV68感染不同模型中的表达，并通过基因敲除鉴定其抗病毒功能。

研究人员开展的研究与总体结论：研究人员利用三个独立感染模型的RNA测序（RNA-seq）数据，结合逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）验证，发现mSlfn4、mSlfn5和mSlfn8在MHV68感染中普遍被诱导。进一步发现mSlfn8在低感染复数（multiplicity of infection, MOI）感染和病毒DNA复制被抑制的条件下表达显著增强。通过siRNA敲降和CRISPR/Cas9敲除mSlfn2、mSlfn8和mSlfn9，研究人员证实mSlfn2和mSlfn8缺失可使MHV68滴度提高约6-10倍，从而将二者确定为MHV68在鼠成纤维细胞中的限制因子。该研究支持MHV68可能通过拮抗干扰素诱导的mSlfn表达来促进有效复制的模型，为理解Schlafen家族在γ疱疹病毒天然免疫防御中的作用提供了新证据。

关键技术与方法：研究人员使用已发表和自产的RNA-seq数据，样本来源包括NIH 3T3成纤维细胞、A20-HE-RIT B细胞和C57BL/6原代腹腔巨噬细胞三种MHV68感染模型；通过RT-qPCR验证mSlfn表达；采用siRNA介导的敲降和CRISPR/Cas9技术构建mSlfn2、mSlfn8和mSlfn9敲除细胞系，并经ICE分析验证；使用半数组织培养感染剂量（50% tissue culture infectious dose, TCID₅₀）法测定病毒滴度；结合细胞生长曲线和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放实验评估细胞增殖与死亡。

研究结果：

3.1 MHV68感染诱导mSlfn表达。对NIH 3T3成纤维细胞（MOI=5，18 h）、原代腹腔巨噬细胞（MOI=10，24 h）和A20-HE-RIT B细胞（多西环素诱导裂解再激活，24 h）的RNA-seq分析显示，mSlfn4、mSlfn5和mSlfn8在所有感染模型中均被诱导，但表达水平和相对占比因细胞类型而异。在NIH 3T3中，mSlfn8诱导约2.6倍，且与hSLFN11具有约60%氨基酸一致性、与hSLFN13具有约64%一致性。

3.2 膦乙酸（phosphonoacetic acid, PAA）处理和低MOI感染增强mSlfn8表达。RT-qPCR显示，在MOI=5感染时mSlfn8难以检测（Ct值大于35）；加入PAA抑制病毒DNA复制后，mSlfn8被显著诱导。已发表RNA-seq数据显示PAA可使一组干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene, ISG）的表达进一步增强。低MOI（0.05）感染时，mSlfn8在2 dpi开始表达，3 dpi达到峰值，诱导强度比高MOI感染强约1000倍。

3.3 靶向mSlfn8/9的siRNA对MHV68滴度影响有限。由于mSlfn8与mSlfn9的mRNA一致性达93%，SMARTpool siRNA同时降低两者表达。敲降后病毒滴度在3 dpi升高2-9倍，但未达统计学显著；MHV68晚期基因gB mRNA表达无差异。该结果提示使用高度保守基因家族时需要严格验证敲降效果。

3.4 mSlfn-KO细胞的验证与生长分析。研究人员用CRISPR/Cas9和两个独立sgRNA分别敲除mSlfn2、mSlfn8、mSlfn9，ICE分析确认敲除。所有mSlfn-KO细胞生长加快，倍增时间由对照的25.2 h缩短至12-19 h，其中mSlfn2-KO最显著。因此后续感染实验在100%汇合单层上进行，以避免生长差异影响病毒滴度。

3.5 mSlfn-KO细胞支持MHV68更高滴度复制。在MOI=0.05感染3 dpi时，两个独立mSlfn2-KO和两个独立mSlfn8-KO克隆的病毒滴度均较对照提高约6-10倍；mSlfn9-KO1有提高，mSlfn9-KO2未重复出该表型。LDH释放实验显示，感染后的mSlfn-KO细胞LDH释放低于感染对照，提示mSlfn缺失可能减少感染相关细胞死亡。

讨论与结论：讨论部分指出，mSlfn8在低MOI或PAA处理条件下高表达，而在高MOI感染时表达较低，提示MHV68可能存在拮抗干扰素应答的机制。mSlfn2和mSlfn8在结构域组成和功能上存在差异：mSlfn2为I组蛋白，缺乏内切酶活性，可结合并保护tRNA；mSlfn8为III组蛋白，含内切酶活性位点和解旋酶结构域，可在体外切割tRNA，因此二者可能通过不同机制限制MHV68。研究局限性包括：敲除均在NIH 3T3成纤维细胞中完成，体内天然感染的B细胞、巨噬细胞和树突状细胞中的功能可能不同；未进行回补实验，不能完全排除脱靶编辑或细胞适应；mSlfn8与mSlfn9可能存在功能冗余；MHV68中负责拮抗mSlfn8的具体病毒因子未知。综上，mSlfn8和mSlfn2是MHV68感染中发挥抗病毒作用的效应因子；mSlfn8的诱导、MHV68可能的拮抗以及敲除后病毒复制增强，支持mSlfn8作为感染诱导抗病毒应答组成部分的模型。这些发现扩大了Schlafen蛋白在疱疹病毒感染中作用的认识，并为后续揭示其限制γ疱疹病毒复制的分子机制奠定了基础。