Crb2a介导的背侧先行细胞（DFCs）聚集将外包运动与斑马鱼脊索延伸相耦联

《Current Biology》：Dorsal forerunner cells couple epiboly movements to zebrafish notochord extension

　　

汇聚延伸（convergence and extension, C&E）细胞运动促进前后轴延伸，并在原肠胚形成过程中使神经外胚层和中胚层组织变窄。中外侧细胞插入在很大程度上负责脊椎动物这一形态发生过程，但证据提示，周围组织产生的额外细胞外源力参与许多结构的塑造。例如在斑马鱼中，前脊板向前迁移产生的机械力与组织自主性细胞插入协同促进脊索延伸。在此，研究人员提出一个脊索形态发生新模型：包被层（enveloping layer, EVL）内的外包力通过一簇背侧先行细胞（dorsal forerunner cells, DFCs）传递至脊索后端，该细胞簇物理连接两者。研究人员发现，分别由crb2a^?/?或sox32缺失引起的DFCs分散或缺失，会降低脊索C&E并加剧平面细胞极性（planar cell polarity, PCP）信号缺陷胚胎的轴延伸缺陷。利用自动图像分割和细胞形状分析流程，研究人员显示，当DFCs分散或缺失时，后部脊索内细胞不能正确伸长。最后，研究人员证明，在无外包发生且所有延伸均由细胞内在行为驱动的斑马鱼胚胎外植体中，crb2a和sox32缺失不能破坏C&E。总之，这些发现支持如下模型：在原肠胚形成期间，DFCs促进包被层与后部脊索的机械耦联，以确保脊索稳健的形态发生。

原肠胚形成过程中，汇聚延伸（convergence and extension, C&E）通过中外侧（mediolateral, ML）细胞插入等平面极性细胞行为促进前后轴延长，并使神经外胚层和中胚层变窄；平面细胞极性（planar cell polarity, PCP）信号是这些细胞行为定向的重要基础，但独立于PCP的调控线索仍不清楚。既有证据表明，邻近组织产生的细胞外在力参与轴延伸，例如斑马鱼前脊板向前迁移可牵拉脊索；然而，脊索后端是否以及如何接受外包（epiboly）运动产生的力尚不明确。Nodal信号可促进C&E且至少部分不依赖中胚层形成，但其下游形态发生效应因子未知。研究人员以Nodal依赖的候选基因crb2a为切入点，因Crb2^?/?小鼠原肠胚轴缩短变宽且Crumbs2可影响肌球蛋白各向异性；斑马鱼crb2a在原肠胚形成中的作用此前未被研究。背侧先行细胞（dorsal forerunner cells, DFCs）位于背侧边缘、随包被层（enveloping layer, EVL）外包并与脊索后端保持接触，因此该研究检验DFCs是否将外包运动与脊索延伸耦联。研究综合遗传、形态计量、活体成像和胚胎外植体实验，发现crb2a缺失导致DFC分散并特异性降低脊索C&E；去除DFCs可模拟该表型，而DFC分散或缺失使后部脊索细胞极化受损；在无外包的胚胎外植体中，crb2a或sox32缺失不再破坏C&E。结论支持DFCs作为机械耦联装置，将EVL外包力传递至后部脊索以增强其C&E，揭示细胞内在力与外在力协同保障发育稳健性的机制，意义在于为脊索形态发生和原肠胚轴延伸提供新的细胞非自主机制。

关键技术方法：研究使用多导引CRISPR构建crb2a F0 crispants及稳定crb2a^{bcm122/bcm122}突变体，并以sox32吗啉代寡核苷酸（morpholino, MO）在1-cell或512-cell期注射去除DFCs/内胚层；采用全胚原位杂交（whole-mount in situ hybridization, WISH）和免疫荧光（immunofluorescence, IF；含酪胺信号放大，tyramide signal amplification, TSA）检测表达与定位；用活体延时共聚焦成像结合Cellpose 2.0分割和FIJI细胞形状分析量化脊索细胞伸长、排列和宽度；用斑马鱼胚胎外植体（embryonic explants）及CA-acvr1b^?诱导延伸。样本来源为AB野生型、Tg(sox17:egfp)^s870tg、Tg(flh:kaede)^vu376tg、Tg(lhx1a:gfp)^pt303tg及本研究crb2a^bcm122斑马鱼胚胎。

结果：（1）crb2a缺失破坏前后轴延伸和脊索C&E：通过crb2a crispants和稳定突变体的WISH形态计量，发现前后轴缩短、脊索变宽而神经板宽度不受影响；crb2a缺失加剧vangl2 crispants的脊索缺陷，提示其作用独立于PCP。（2）crb2a在原肠胚形成期间表达于DFCs：WISH和双色WISH显示crb2a在盾期后边缘细胞群表达并与sox32共表达，MZoep^?/?中DFC表达缺失；IF显示Crb2a定位于DFCs膜及Kupffer’s vesicle（KV，库普弗囊泡）顶端。（3）crb2a是外包期间DFC聚集所必需：双色WISH和活体Tg(sox17:egfp)延时成像显示crb2a缺失胚胎DFCs分散，直至卵黄栓闭合才聚集；胚胎边缘凸度降低，EVL与深层细胞间隙在背侧增宽。（4）DFCs促进正常外包和脊索C&E：sox32 MO在1-cell和512-cell期去除DFCs/内胚层后，胚胎出现轴缩短和脊索变宽而神经板不受影响；crb2a/sox32双缺失不加剧sox32单缺失表型；EVL与深层细胞间隙背侧增宽，卵黄栓闭合缺陷增加。（5）DFCs是后部脊索细胞极化所必需：活体延时共聚焦和自动细胞形状分析显示crb2a^?/?及sox32 morphants中邻近边缘的脊索细胞伸长失败，而边缘和远处细胞基本正常，脊索变宽。（6）crb2a通过DFCs与外包运动耦联促进C&E：在无外包的CA-acvr1b^?诱导胚胎外植体中，crb2a或sox32缺失不影响外植体长宽比及脊索特异性延伸；DFC数量也不影响外植体脊索延伸，支持DFCs传递外包力的模型。

讨论部分总结：作者讨论强调细胞外在力在形态发生中的作用，并将DFCs传递外包力与斑马鱼前脊板牵拉脊索前端相类比；DFCs被描述为“拖车挂钩”，将EVL的强外包力传递至后部脊索，脊索细胞自身插入提供内在力，二者协同增强C&E稳健性。讨论还指出Crb2a在DFCs中的作用超出维持顶端表面，DFC分散此前未被充分与C&E缺陷关联，部分因轴延伸缺陷较温和而被忽视。研究结论翻译：这些发现支持一个模型，即DFCs在原肠胚形成期间促进包被层与后部脊索的机械耦联，以确保脊索稳健的形态发生；该工作强调细胞内在力和细胞外在力如何协同确保原肠胚形成期间的发育稳健性。