中药启发的砷掺杂碳点纳米制剂用于急性早幼粒细胞白血病异种移植模型的有效治疗

《International Journal of Nanomedicine》：Chinese Medicine Led As-Doped Carbon Dot Nanoformulation for Effective Against Acute Promyelocytic Leukemia in Xenograft Model

　　

目的：急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）可经三氧化二砷（arsenic trioxide, ATO）和全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）有效治疗，但砷相关全身毒性仍是重要临床问题。本研究旨在开发一种受中药启发的砷掺杂碳点（arsenic-doped carbon dots, As-CDs）纳米平台用于APL治疗。方法：以枣（Jujubae fructus）为生物质碳前体、以砷华（Arsenic sublimate）为砷源，通过热解制备As-CDs；系统评价其理化性质、砷形态、细胞摄取、细胞毒性、活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成、线粒体膜电位、凋亡、分化相关效应、药代动力学、体内抗白血病疗效和生物安全性。结果：As-CDs分散性良好，粒径约1.64 nm；晶体排列类似石墨烯，荧光稳定性良好；绝对量子产率（absolute quantum yield, QY）为14.3%，碳材料中As(III)/As(V)摩尔比为2.08，提示砷主要以三价形式存在，这一点关键。在HL-60细胞实验中，As-CDs处理后细胞内ROS水平升高，线粒体膜去极化，凋亡被促进；同时CD11b表达升高、PML-RARα蛋白水平降低，这些变化提示其分化相关效应。在动物移植瘤模型中，As-CDs对局部肿瘤生长有显著抑制作用，骨髓中白血病细胞浸润也显著减少。药代动力学研究进一步显示，其全身分布特征与单用砷时显著不同。血液学、生化和组织病理学检查结果显示，在实验条件下该药物短期生物安全性较好。结论：本研究制备了对APL具治疗作用的As-CDs；其作用机制与ROS诱导的线粒体途径凋亡有关，并伴PML-RARα蛋白水平下调和细胞分化诱导。该受中药思想启发的策略为含砷纳米药物开发提供了有前景的框架，并具良好短期生物安全性。

研究背景：急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）是急性髓系白血病M3亚型，分子特征为PML-RARα融合基因（PML-RARα fusion gene）；该融合蛋白异常抑制髓系成熟所需基因转录，导致早幼粒细胞阶段分化阻滞和未成熟早幼粒细胞病理性蓄积。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）和三氧化二砷（arsenic trioxide, ATO）进入临床后通过作用于PML-RARα重启髓系分化，使APL由高死亡率转为高治愈率；但ATO治疗窗较窄，剂量升高易出现全身毒性，包括潜在致命心脏毒性（如QTc间期延长）、肝毒性和肾功能异常，限制其临床转化和长期使用。因此需要能选择性蓄积于肿瘤部位、同时保护正常组织免受游离砷暴露的递送系统。传统纳米载体如脂质体和聚合物纳米粒在复杂生物液体环境中稳定性不足、易提前泄漏且制备复杂；荧光碳点（carbon dots, CDs）尺寸通常小于10 nm，可通过化学键将金属或类金属活性原子掺入稳定碳骨架，避免药物提前泄漏并改善稳定性、发光可调性和生物相容性。中药（traditional Chinese medicine, TCM）资源及历史炮制经验（包括煅烧和升华）与现代热解掺杂合成在物理化学性质上相似。研究人员据此以枣（Jujubae fructus）为生物质碳前体、以砷华（Arsenic sublimate）为砷源，构建砷掺杂碳点（arsenic-doped carbon dots, As-CDs），期望细胞摄取后触发活性氧（reactive oxygen species, ROS）爆发、破坏线粒体膜电位、诱导凋亡并降低PML-RARα水平、促进分化，同时避免常规砷治疗的器官损伤。研究人员系统评价了其理化性质、砷形态、细胞摄取、细胞毒性、ROS生成、线粒体膜电位、凋亡、分化相关效应、药代动力学（pharmacokinetics, PK）、体内抗白血病疗效和生物安全性；结论为As-CDs对APL具治疗作用，机制与ROS诱导线粒体途径凋亡有关，并伴PML-RARα蛋白水平下调和细胞分化诱导；该中药思想启发的策略为含砷纳米药物开发提供有前景框架，并具良好短期生物安全性。其重要意义在于将传统医学实践与精准纳米医学相连接，为更安全的靶向APL治疗提供候选平台。

关键技术方法（不超过250字）：热解法制备As-CDs，以荧光量子产率筛选前体质量比、煅烧温度和反应时间；用透射电子显微镜（TEM）、高分辨TEM（HRTEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、拉曼光谱、动态光散射（DLS）、紫外-可见吸收光谱、光致发光（PL）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）表征及检测砷负载/释放；以HL-60细胞和人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs；购自Bolsen Biotechnology Co., Ltd.）进行摄取、CCK-8毒性、溶血、ROS、JC-1线粒体膜电位、Annexin V-FITC/PI凋亡、CD11b流式和PML-RARα免疫印迹；建立雌性BALB/c裸鼠（4–5周龄，18–22 g，许可证SCXK（YUE）2021–0041）HL-60皮下异种移植模型评价疗效、骨髓浸润和生物安全；以Sprague-Dawley（SD）大鼠（许可证SCXK(YUE)2021–0041）进行药代动力学。

结果：1. 合成、形貌与结构表征：通过量子产率筛选确定枣/砷华质量比40:1、575 ℃、1 h；TEM/HRTEM显示As-CDs为单分散球形、平均直径1.64±0.41 nm、晶格间距0.21 nm，XRD见2θ≈24°峰，FT-IR示O-H、C-H、C=O、C-N、C-O-C等基团，拉曼光谱示As-CDs的I_D/I_G由H-CDs的1.40升至1.54，提示砷掺杂增加结构缺陷。2. 元素组成与砷掺杂分析：XPS示C、N、O、As原子百分比分别为72.96%、1.49%、24.79%、0.76%；As 3d峰44.36和45.63 eV分别对应As(III)和As(V)，As(III)/As(V)约2.08；ICP-MS示总砷浓度19.35 mg/L、砷负载6.77 wt%；透析72 h约释放28.07%，提示早期泄漏相对有限。3. 光学性质与稳定性：Zeta电位As-CDs为?27.5 mV、H-CDs为+32.8 mV；UV-Vis吸收峰237和345 nm，最佳激发324 nm、最大发射423 nm，量子产率14.3%；pH 2–13下荧光较稳定，1 M NaCl下荧光下降小于15%，连续UV照射120 min保留91%。4. 细胞内化与选择性细胞毒性：CLSM示HL-60细胞胞质绿色荧光随时间增加；CCK-8示As-CDs浓度依赖性降低HL-60活力，IC₅₀为30.58 μg/mL；PBMCs在200 μg/mL时仍保持90%以上活力，提示体外选择性较好。5. ROS相关线粒体功能障碍与凋亡：DCFH-DA探针示As-CDs升高细胞内ROS；JC-1示红荧光转绿、绿/红比升高，提示线粒体膜电位崩溃；Annexin V-FITC/PI示凋亡率剂量依赖性增加，提示ROS相关线粒体功能障碍和凋亡。6. PML-RARα降解与分化相关效应：流式示CD11b表达上调；Western blotting示PML-RARα蛋白水平明显下调，提示分化相关表型及分化阻滞缓解。7. 体内抗白血病疗效：建立HL-60皮下异种移植模型，尾静脉每3天给药共6次；低、高剂量抑瘤率分别为52.80%和66.60%；H&E示肿瘤细胞密度降低、排列疏松、细胞间隙增大；外周白细胞（peripheral white blood cell, PWBC）降低；未设ATO/ATRA阳性对照。8. 骨髓浸润减轻：流式抗人CD45⁺抗体示肿瘤组织和骨髓中人CD45⁺白血病细胞比例较盐水组显著降低（P<0.01），提示局部和系统白血病负荷下降。9. 体内生物安全性评价：体重稳定；红细胞、血红蛋白、血小板等无显著异常；ALT、AST、BUN、CRE无治疗相关显著偏差；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色示心、肝、脾、肺、肾白血病浸润较少、组织结构较好，提示实验条件下短期生物安全性良好。10. 药代动力学：SD大鼠静脉给予游离As(III)或As-CDs（0.75 mg/kg等效砷）；As-CDs组AUC_0–t和C_max较低，T_1/2和MRT_0–t缩短，提示体内分布改变、全身砷暴露降低、血浆滞留时间缩短。

讨论总结：讨论部分强调As-CDs兼具ROS-线粒体凋亡与PML-RARα下调/分化恢复的双通路机制，短期安全性和药代行为较游离砷改善，同时指出未设标准ATO/ATRA阳性对照、未探索主动靶向或特异性摄取、长期生物安全需延长观察等局限。研究结论翻译：受中药炮制与现代纳米技术启发，本研究以生物质为原料构建了治疗APL的砷掺杂纳米治疗剂As-CDs。具体以生物相容性良好的枣为碳源、以具治疗作用的砷华为掺杂剂，通过绿色合成将生物活性元素直接嵌入荧光碳骨架。所得As-CDs形貌均匀、光学性质良好，在生理条件下稳定。体内实验示As-CDs可显著抑制肿瘤生长并减少骨髓白血病细胞浸润，支持其治疗APL潜力。但本研究未设标准ATO/ATRA阳性对照组，不能与当前一线治疗直接比较；未来需选择临床相关对照药以进一步明确As-CDs的相对疗效。机制上，As-CDs可提高细胞内ROS水平，打破线粒体稳态，使线粒体膜去极化并激活凋亡；同时降低PML-RARα融合蛋白表达，诱导阻滞的早幼粒细胞分化为成熟中性粒细胞。因此，其抗白血病作用可从两条互补通路理解：ROS所致线粒体途径凋亡和PML-RARα相关的分化功能恢复。结合现有文献证据，这些发现进一步证实此前提出的As-CDs抗白血病机制。此外，本研究评价了短期体内安全性，未观察到明显不良反应。鉴于碳质纳米材料可被网状内皮系统（reticuloendothelial system, RES）滞留，未来需延长观察期以全面评价As-CDs生物安全性。药代动力学分析示As-CDs体内代谢处置较游离砷改善。As-CDs具1.64 nm超小流体动力学尺寸优势，但本研究未探索主动靶向或特异性摄取机制；因此需进一步研究其生物分布并确定是否优先蓄积于肿瘤组织。总体而言，本研究不仅为APL治疗提供有效且安全的纳米平台，也体现中药与精准纳米医学的融合。