血浆细胞外囊泡多组学特征揭示脓毒症进展过程中的动态分子重塑

《International Journal of Nanomedicine》：Plasma Extracellular Vesicles Multi-Omics Signatures Reveal Dynamic Molecular Rewiring During Sepsis Progression

　　

背景：脓毒症（sepsis）具有持续高死亡率，进展为弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation, DIC）后风险显著升高。尽管循环细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）已被视为脓毒症相关DIC（SA-DIC）的潜在生物标志物储库和致病介质，但调控脓毒症经脓毒症诱导凝血病（sepsis-induced coagulopathy, SIC）向SA-DIC转变的分子机制仍不清楚。 方法：研究人员对健康对照（n=3）及脓毒症、SIC和SA-DIC患者（n=6）的血浆EVs进行纵向采集，并采用RNA测序和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行多组学分析（miRNome、蛋白质组和代谢组）。关键发现在独立纵向队列（n=30）中通过qRT-PCR和ELISA验证。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中使用miRNA agomir和antagomir研究miR-34a-5p在脂多糖（LPS）诱导的炎症和促凝血反应中的作用。在盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的SA-DIC小鼠模型中给予miR-34a-5p agomir/antagomir，评估凝血和炎症参数及肺、肝、肠组织病理学变化。 结果：整合多组学分析鉴定出112个miRNAs、525个蛋白质和60个代谢物在脓毒症进展过程中于血浆EVs中差异表达，这些分子富集于血液凝固、血小板活化、炎症反应、能量代谢和维生素代谢通路。研究人员将miR-34a-5p鉴定为可区分脓毒症、SIC和SA-DIC的生物标志物。体外实验中，miR-34a-5p下调可减轻炎症、减少血栓调节蛋白（thrombomodulin）分泌，并增加CD138和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate）表达。一致地，体内调节miR-34a-5p可改善凝血功能障碍及肺、肝、肠道组织病理学损伤。 结论：该研究首次提供了脓毒症进展过程中血浆EVs分子重编程的整合图谱，确定了潜在的诊断生物标志物和候选治疗靶点。

论文解读：血浆细胞外囊泡多组学特征揭示脓毒症进展中的动态分子重塑

一、研究背景与目的

脓毒症被定义为由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。尽管重症医学取得了长足进步，脓毒症仍是高致死性综合征，其年发病率约为每10万人270例，病死率接近26%。当脓毒症进展为脓毒症诱导凝血病（SIC）时，90天死亡风险较无SIC的脓毒症患者增加近两倍；一旦发展为弥散性血管内凝血（DIC），病死率超过40%。因此，早期诊断和积极干预SIC及DIC对改善脓毒症预后至关重要。

细胞外囊泡（EVs）与脓毒症的机制关联最早于1998年在内毒素血症猪模型中得到证实。此后大量证据表明，循环EVs既是潜在的生物标志物储库，也是脓毒症的致病介质。EVs具有功能双重性：病原体来源的外膜囊泡和宿主来源的促炎性EVs可诱导脓毒症或全身炎症反应综合征；而某些EVs亚群则可通过清除活性氧、抑制炎症因子产生、调节巨噬细胞极化和凋亡等发挥保护作用。在诊断方面，EVs已被证明比C反应蛋白、白细胞计数和白细胞介素-6等传统临床炎症标志物更早检测脓毒症。然而，EVs所携带分子的具体身份以及调控脓毒症经SIC向SA-DIC转变的机制基础仍 largely 未被探索。为填补这一空白，研究人员分离血浆EVs以最大程度减少丰富血浆蛋白的干扰，提高低丰度生物标志物的检测灵敏度，并进行多组学分析以对该病理轴进行全面无偏的探究。

二、研究内容与主要结论

本研究对健康对照（n=3）和脓毒症、SIC、SA-DIC患者（n=6）纵向采集的血浆EVs进行miRNome、蛋白质组和代谢组多组学分析，并在独立纵向队列（n=30）中通过qRT-PCR和ELISA验证关键发现。研究鉴定出112个差异表达miRNAs、525个差异表达蛋白质和60个差异代谢物，这些分子富集于血液凝固、血小板活化、炎症反应、能量代谢和维生素代谢通路。研究人员将miR-34a-5p鉴定为可区分脓毒症、SIC和SA-DIC的生物标志物。体外实验表明miR-34a-5p下调可减轻LPS诱导的炎症和促凝血反应；体内实验证实调节miR-34a-5p可改善凝血功能障碍及多器官组织病理损伤。该研究首次提供了脓毒症进展过程中血浆EVs分子重编程的整合图谱，为SA-DIC的早期诊断和靶向治疗奠定了分子基础。

三、关键技术与方法

研究人员采用的主要技术方法包括：对血浆样本进行差速超速离心分离EVs，并通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和Western blotting进行表征；对EVs RNA进行小RNA文库构建和Illumina HiSeq 2500平台双端测序；对EVs蛋白质进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析；对EVs代谢物进行基于UHPLC-Orbitrap Exploris 480的非靶向代谢组学分析；采用DESeq2进行差异miRNA分析，Proteome Discoverer进行蛋白质鉴定，XCMS进行代谢物峰检测；构建miRNA-蛋白质调控网络和代谢物-蛋白质相互作用网络；在HUVECs中进行miRNA agomir/antagomir转染实验；在CLP诱导的SA-DIC小鼠模型中进行体内干预实验。样本队列包括发现队列（n=9；3例健康对照和6例患者）和验证队列（n=60；30例健康对照和30例患者），均来自北京积水潭医院。

四、主要研究结果

受试者特征：共纳入69名受试者，包括33名健康对照和36名脓毒症、SIC、SA-DIC患者，分为发现队列和验证队列。

EVs表征：TEM显示EVs呈典型圆形杯状形态，NTA显示粒径约100-200 nm，Western blot确认EVs特异性标志物CD9和Alix阳性，阴性标志物calnexin阴性。

脓毒症发展过程中血浆EVs miRNAs的动态图谱：PCA显示脓毒症、SIC和SA-DIC来源的血浆EVs具有明显不同的miRNome聚类。共鉴定出112个差异表达miRNAs，其中脓毒症vs对照44个、SIC vs脓毒症3个、SA-DIC vs SIC 33个、SA-DIC vs脓毒症32个。GO富集分析显示各阶段均富集血液凝固、血小板活化和炎症反应等生物学过程；KEGG通路分析显示PI3K-Akt信号通路和血小板活化在健康对照-脓毒症-SIC-SA-DIC进展中持续富集。

血浆EVs差异表达蛋白质的蛋白质组学分析：共鉴定出525个差异表达蛋白质，其中脓毒症vs对照409个、SIC vs脓毒症15个、SA-DIC vs SIC 37个、SA-DIC vs脓毒症64个。GO富集分析显示疾病进展涉及免疫效应过程正调控、补体激活、纤溶酶原激活调控和乳酸代谢过程等功能转变。

血浆EVs非靶向代谢组学分析：脂质和类脂分子占差异代谢物最大比例（29.55%）。共鉴定出60个差异代谢物。MSEA显示各阶段分别富集甘油磷脂代谢、谷胱甘肽代谢、α-亚麻酸代谢、氧化磷酸化和维生素消化吸收等通路。

miRNome、蛋白质组和代谢组的纵向分析：Mfuzz时间序列聚类将分子分为8种表达模式。补体通路组分（C1QB、C1QC、C5AR1、CFHR1）从脓毒症经SIC到SA-DIC逐步升高；促凝血因子（F2、F7、F9、F11）和PLG在SA-DIC相对SIC显著下调，而SDC-1和HS显著上调。精氨酸和瓜氨酸在脓毒症到SIC转变中上调，随后从SIC到SA-DIC下降。乳酸和丙酮酸持续上调，提示微循环灌注受损。

代谢物-基因-疾病相互作用网络：瓜氨酸成为代谢物节点中的中心枢纽，花生酸富集于网络中。代谢物-基因网络鉴定出5个核心调控基因——LCN2、PARK7、RAB4A、PCCB和ECHS1，分别涉及炎症、血小板功能和能量代谢。

miRNA-蛋白质互作网络：SERPINE1（编码PAI-1）被鉴定为中心枢纽，与多个miRNAs广泛连接。miR-34a-5p、miR-497-5p、miR-21-5p、miR-128-3p、miR-125b-5p和miR-150-5p被鉴定为核心调控因子，共同靶向纤溶（SERPINE1、PLAT）、血小板功能（PF4、RAB27A）和炎症（MAPK14、PARK7）相关基因。

血浆EVs候选miRNAs的qRT-PCR验证：在30例患者和30例健康对照中验证，miR-34a-5p和miR-21-5p持续上调，miR-128-3p持续下调，miR-125b-5p仅在SA-DIC相对脓毒症显著升高，而miR-150-5p和miR-497-5p无显著组间差异。ROC分析显示miR-34a-5p可有效区分脓毒症、SIC和SA-DIC各阶段。

血浆EVs中PAI-1的ELISA验证：ELISA显示EVs相关PAI-1随疾病阶段逐步升高（脓毒症：2.92±0.49；SIC：3.21±0.61；SA-DIC：5.39±1.66 pg/μg总EVs蛋白），ROC分析显示PAI-1可有效区分SA-DIC与脓毒症和SIC。

miR-34a-5p调节HUVECs中LPS诱导的炎症和促凝血反应：miR-34a-5p antagomir显著降低促炎细胞因子CCL2、IL-6和IL-8的分泌及mRNA表达，下调内皮活化标志物CD54（ICAM-1）和可溶性血栓调节蛋白（sTHBD），增加糖萼组分CD138（SDC-1）和硫酸乙酰肝素（HS）的表面表达；miR-34a-5p agomir则产生相反效应。

miR-34a-5p调节SA-DIC小鼠中CLP诱导的炎症和促凝血反应：在CLP诱导的SA-DIC小鼠模型中，miR-34a-5p antagomir显著缩短PT、APTT和TT，增加FIB水平，降低D-dimer、IL-6和PAI-1水平，增加PLT和淋巴细胞计数，减少单核细胞计数，并减轻肺、肝、肠组织的炎症浸润和微血栓形成；miR-34a-5p agomir则加重上述病理改变。

五、讨论与结论

讨论部分指出，严重脓毒症几乎总是伴随凝血级联的系统性激活。本研究的GO富集分析显示脓毒症患者血浆EVs中的miRNAs显著富集于血液凝固和止血相关生物学过程，差异表达蛋白质被注释到纤溶相关功能。PAI-1持续上升提示血浆EVs可能与纤溶抑制相关。血小板在脓毒症相关凝血病中发挥关键作用，血浆EVs中鉴定出多种参与血小板活化的蛋白质。研究还揭示了止血与炎症之间的广泛双向串扰，补体系统作为炎症级联的上游放大器，补体通路组分在疾病进展中逐步升高。能量代谢方面，乳酸和丙酮酸的持续上调提示微循环灌注进行性恶化。维生素代谢方面，多组学分析将血浆EVs与维生素B6代谢、维生素D受体信号及维生素消化吸收等过程相关联。

研究结论指出，该整合多组学分析首次描绘了脓毒症经SIC向SA-DIC进展过程中血浆EVs的动态分子重编程，揭示EVs货物沿血液凝固、血小板活化、炎症反应及能量和维生素代谢通路被重塑。其中，miR-34a-5p成为区分脓毒症、SIC和SA-DIC的候选标志物；体外和体内验证均表明调节miR-34a-5p可减轻炎症反应、改善凝血功能障碍和多器官组织病理损伤。这些发现将EVs相关miR-34a-5p定位为脓毒症相关凝血病有前景的诊断生物标志物和潜在治疗靶点，为阻止脓毒症向SA-DIC进展的精准干预奠定了分子基础。