L-β-(isoxazolin-5-on-2-yl)-alanine（BIA）通过双重抑制O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase与cystathionine γ-synthase发挥抗念珠菌活性

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Anticandidal activity of L-β-(isoxazolin-5-on-2-yl)-alanine due to the inhibition of O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase and cystathionine γ-synthase

　　

L-β-(isoxazolin-5-on-2-yl)-alanine（BIA）在体外对Candida spp.人致病酵母表现出生长抑制活性，MIC₉₀值为0.5–8 μg/mL。BIA在Candida albicans中经Mup1p透性酶（Mup1p permease）转运，随后抑制甲硫氨酸生物合成途径（methionine biosynthetic pathway, MBP）中的O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase Met15p和cystathionine γ-synthase Str2p。BIA与L-penicillamine联合时观察到轻微、临界性协同效应。BIA被确定为Met15p和Str2p的竞争性抑制剂，K_i值分别等于0.711 mM和0.912 mM。BIA在Met15p活性中心结合的分子对接（molecular docking）分析结果提示，该化合物可能作为死端抑制剂（dead-end inhibitor）发挥作用；亦提示BIA对Str2p具有相同抑制机制。BIA是首个已鉴定的同时抑制Met15p和Str2p的抑制剂，对Candida属人致病酵母表现出中等生长抑制活性。

研究背景：系统性真菌病主要发生于免疫受损患者，多由Candida spp.尤其是C. albicans引起；有效化疗药物有限、部分药物耐药上升且部分药物哺乳动物毒性高，且具有所需选择毒性的抗真菌药物分子靶点数量有限。真菌中人类必需氨基酸的生物合成途径，尤其是L-甲硫氨酸生物合成途径（MBP），被视为潜在靶点方向。BIA是grass pea（Lathyrus sativus）等豆科植物幼苗期产生的非蛋白源性氨基酸，已知对酿酒酵母、植物病原真菌和单细胞绿藻有生长抑制作用，对细菌无活性；其抗菌机制未知，但L-Met、L-Cys和L-Hcy可逆转其在S. cerevisiae中的作用，提示靶向MBP中的酶。此前尚未研究BIA对人致病Candida的作用，因此研究人员开展本研究，旨在评价BIA抗Candida体外活性并鉴定其在C. albicans中的分子靶点。研究结论表明BIA经Mup1p进入细胞并同时抑制Met15p和Str2p，从而阻断L-Met合成；BIA是首个同时抑制这两个酶的抑制剂，对Candida属人致病酵母有中等生长抑制活性，为双靶点抗真菌剂设计提供了依据。

关键技术方法（不超过250字）：化学合成BIA并以NMR、HRMS和HPLC-DAD鉴定纯度；按CLSI M27-A3用微量倍比稀释测定Candida参考株及C. albicans CAI4、mup1Δ 128 CAI4的MIC₅₀/MIC₉₀，并以棋盘稀释、FICI和Loewe模型评价BIA与L-PEN联用；构建表达纯化CaMet15NHp、CaStr2NHp等重组酶，用HPLC-DAD-MS/DTNB衍生化测酶活及竞争性动力学；以AlphaFold同源建模和AutoDock进行半柔性及共价对接。未涉及人类样本队列；菌株来源包括Candida参考株及Prof. Patrick van Dijck（KU Leuven, Belgium）馈赠的128 CAI4 mup1Δ菌株等。

研究结果：Chemistry—Synthesis of BIA：以Boc-β-chloro-L-alanine为起点经六步合成BIA，总收率18%，纯度97.4%，NMR和HRMS确证结构。Biological properties—Anticandidal in vitro activity of BIA：在YNB AS、YNB SG和RPMI-1640中测MIC；BIA对C. albicans、C. glabrata、C. parapsilosis、C. tropicalis、C. dubliniensis的MIC₅₀为0.25–4 μg/mL、MIC₉₀为0.5–8 μg/mL，对C. krusei较弱（32–128 μg/mL）。BIA exhibits anticandidal in vitro activity and its growth inhibitory action is reversed upon L-met supplementation：5 mM L-Met在YNB中消除活性；RPMI-1640中活性差或无，该培养基含L-Met约0.1 mM；CAI4与ATCC 10231的MIC相同；0.1 mM L-Met或L-Hcy显著升高MIC，25 μM L-Met仅使MIC升高两倍；C. glabrata中15 μM L-Met约逆转40%，125 μM逆转>90%。Antifungal effect of BIA and L-PEN in combination is stronger than that of each agent alone：棋盘稀释显示BIA与L-PEN联用MIC₅₀分别降至0.25 μg/mL和64 μg/mL（单用分别为1 μg/mL和256 μg/mL），FICI=0.5，属临界协同，实际意义有限。BIA takes advantage of the Mup1p methionine permease as a route of entry into C. albicans cells：128 CAI4 mup1Δ对BIA的MIC>256 μg/mL，而CAI4敏感，提示BIA主要经Mup1p进入C. albicans；25 μM L-Hcy不能逆转而0.1 mM可，提示L-Hcy作用为供Met6p底物，而非竞争Mup1p摄取。Enzyme inhibition—Construction, purification and characterisation of recombinant CaStr2NHp：CaSTR2在E. coli ER2566表达，CaStr2NHp经亲和及尺寸排阻纯化至98%，SDS-PAGE分子量67.5±1.4 kDa，Native-PAGE以单体为主、少量二聚体。BIA is an inhibitor of CaMet15p and CaStr2p：10 mM BIA抑制CaMet15NHp 87.5%、CaStr2NHp 81.1%，对CaMet2NHp仅约6%；CaMet15NHp IC₅₀=1.05 mM，对L-OAH竞争性抑制，K_i=0.711 mM（低于L-OAH的K_M=9.12 mM）；CaStr2NHp IC₅₀=1.76 mM，对L-OAH竞争性抑制，K_i=0.912 mM。In silico analysis of enzyme:inhibitor interactions—BIA binding at CaMet15p active Centre and its hypothetical action as a dead-end inhibitor：AlphaFold建模和AutoDock对接显示BIA在CaMet15p活性中心模拟L-OAH酰基部分，环氧对应酯氧并与Tyr109作用，羰基氧与Arg56作用；结合能L-OAH为?4.70、BIA为?5.75 kcal/mol，但评分不宜量化解释；提出BIA可能为死端抑制剂：可形成PLP加合物，环氧可被Tyr109质子化并可能断O-N键，但因不能释放乙酸且缺少S^2?受体而停滞，该假设需实验验证；TAN-950 A对接接触较差且缺少Tyr109质子受体，不支持其抑制Met15p。The L-OAH binding site of CaStr2p is homologous to that of CaMet15p：CaStr2p模型基于L. plantarum 9VSM，关键残基与CaMet15p对应（Arg572/Lys407/Arg47/Tyr312/Tyr45对Arg415/Lys207/Arg56*/Tyr109/Tyr54*），提示二者L-OAH位点高度同源，BIA对Str2p亦可能为死端抑制；实验证实其为竞争性抑制。

讨论部分总结：BIA在最小YNB培养基中抗念珠菌活性较好，但在含L-Met培养基（包括CLSI推荐的RPMI-1640）中明显降低，需与L-Met竞争Mup1p摄取，可能是其抗真菌应用限制；临床菌株若MUP1下调或Mup1p亲和力降低可能产生BIA耐药。微生物甲硫氨酸营养缺陷型在人血清中增殖能力显著降低，人血清L-Met不高于50 μM；此前还发现C. glabrata经L-PEN处理后恢复生长所需L-Met>1 mM。因此，绕过Mup1p转运屏障可能提高BIA在含甲硫氨酸介质和人血清中的抗真菌活性，Trojan horse策略（将BIA转为经其他途径入胞、胞质降解释放BIA的衍生物）是进一步研究方向。已知Met15p/Str2p抑制剂很少：Kulikova et al.报道AcDAB和L-propargylglycine抑制细菌Met15p；AcDAB对CaMet15p IC₅₀=4.8 mM但无抗念珠菌活性；Str2p抑制剂包括L-propargylglycine（细菌）和2-amino-5-phosphono-3-pentenoic acid（植物），前者对植物病原真菌有中等作用但抗念珠菌活性未知。BIA是迄今唯一同时抑制Met15p和Str2p并具中等抗Candida活性的抑制剂，提示可理性设计更优双靶点抑制剂。

研究结论翻译：BIA此前被报道对植物病原真菌有杀菌活性，现显示对多种人致病Candida酵母具有生长抑制活性。对C. albicans作用机制研究显示，BIA经甲硫氨酸特异性透性酶Mup1p摄取，随后抑制MBP中的O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase Met15p和cystathionine γ-synthase Str2p，从而有效阻断L-Met生物合成。BIA同时抑制Met15p和Str2p，是因为其与二者天然底物L-OAH结构类似；BIA对两者均为相对L-OAH的竞争性抑制剂，最可能为死端型。值得注意的是，迄今已知的Met15p或Str2p底物类似物抑制剂很少。Kulikova et al.鉴定L-4-acetamido-2-aminobutanoic acid（AcDAB）和L-propargylglycine为细菌Met15p强抑制剂；但研究人员此前对CaMet15p候选抑制剂的研究发现，AcDAB对该酶IC₅₀=4.8 mM，却在最小培养基中完全无抗念珠菌体外活性。已鉴定的Str2p抑制剂包括靶向细菌Str2p的L-propargylglycine和抑制植物酶的2-amino-5-phosphono-3-pentenoic acid；前者对植物病原真菌有中等生长抑制作用，但其抗念珠菌活性未知。因此，BIA是迄今唯一同时抑制Met15p和Str2p、并对Candida属人致病真菌具有中等生长抑制活性的抑制剂。研究人员认为，有可能理性设计具有比BIA更佳酶抑制和抗真菌特性的其他双靶点抑制剂。BIA在最小YNB培养基中抗念珠菌体外活性良好，但在含L-Met培养基（包括CLSI推荐的RPMI-1640）中低得多。需与L-Met竞争Mup1p介导摄取似乎是BIA作为抗真菌剂的重要限制；此外，临床菌株中若出现导致MUP1表达下调或Mup1p对该剂亲和力降低的突变，可能产生BIA耐药。值得注意的是，微生物甲硫氨酸营养缺陷型在人血清中增殖能力显著降低，而人血清L-Met水平不高于50 μM；研究人员此前还发现，L-PEN处理C. glabrata后在YNB中恢复生长缺陷所需L-Met浓度高于1 mM。因此可以推测，绕过Mup1p转运屏障可能提高BIA在含甲硫氨酸介质和人血清中的抗真菌活性。一种可能途径是利用Trojan horse策略，即将BIA转化为经Mup1以外途径进入真菌细胞、随后在胞质中降解释放BIA的衍生物；进一步研究旨在实现该目标。