《Current Issues in Molecular Biology》：Sida rhombifolia L. Reduces Acute Inflammation and NF-κB/AP-1-Driven SEAP Reporter Activity in TPA- and LPS-Stimulated RAW-Blue? Cells
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摘要：黄花稔（Sida rhombifolia L.）传统上用于治疗与炎症相关的疾病。在本研究中，研究人员评估了正己烷提取物（SrHex）、乙酸乙酯提取物（SrAcOEt）和甲醇提取物（SrMeOH）在雄性CF-1小鼠TPA（12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙
摘要：黄花稔（Sida rhombifolia L.）传统上用于治疗与炎症相关的疾病。在本研究中，研究人员评估了正己烷提取物（SrHex）、乙酸乙酯提取物（SrAcOEt）和甲醇提取物（SrMeOH）在雄性CF-1小鼠TPA（12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯）诱导的耳廓水肿实验中的效果。活性最强的提取物SrHex被进一步分离为H-F1至H-F5五个馏分。通过组织学分析以及在TPA或LPS（脂多糖）刺激的RAW-Blue?巨噬细胞衍生细胞系中，对选定馏分进行了进一步评估。测定了细胞活力及NF-κB/AP-1驱动的SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）报告基因活性，并通过GC-MS对H-F3和H-F5馏分进行了化学表征。在三种提取物中，SrHex表现出最强的抗炎活性，而H-F3是在TPA诱导的水肿模型中最活跃的馏分。组织学和形态计量学分析显示，SrHex以及H-F1至H-F3馏分能够减轻TPA诱导的表皮/皮下组织厚度和胶原层厚度的增加。在TPA刺激的RAW-Blue?细胞中，SrHex和H-F1至H-F3馏分在不显著损失细胞活力的前提下，降低了NF-κB/AP-1驱动的SEAP报告基因活性。在LPS刺激的细胞中，SrHex和H-F2至H-F5馏分产生了浓度依赖性的SEAP报告基因活性降低，同时基本保持了细胞活力。H-F5在报告基因检测中显示出最高的表观效力，其IC50为20.63 μg/mL，最大效应（Emax）为98.04%。H-F1也降低了SEAP报告基因活性，但由于较高浓度伴随细胞活力信号的降低，因此对这些浓度的效果应谨慎解读。通过GC-MS初步分析，在H-F3中鉴定出二氢猕猴桃内酯、2-亚甲基-5α-胆甾烷-3β-醇和己二酸单（2-乙基己基）酯；而在H-F5馏分中，鉴定出了环丙烷十四烷酸2-辛基甲酯和3′,8,8′-三甲氧基-3-哌啶基-2,2′-联萘-1,1′,4,4′-四酮。总体而言，黄花稔在TPA模型中显示出抗炎活性，并在受刺激的RAW-Blue?细胞中调节了与NF-κB/AP-1相关的报告基因活性。
研究背景与目的
炎症是机体应对感染和组织损伤等有害刺激的一种适应性反应，在宿主防御和组织修复中发挥核心作用。然而，当炎症刺激持续存在或调控机制失效时，急性炎症可能转化为慢性炎症，进而促进多种病理状况的发生与发展。黄花稔（Sida rhombifolia L.）在墨西哥等地传统上被用于缓解牙痛、治疗牙龈炎、胃溃疡及各种炎症性疾病。前期药理学研究已报道了该物种在大鼠根尖周病变模型中的抗炎效果，以及对环氧合酶1和2的抑制作用。尽管已有研究证实了黄花稔的抗炎潜力，但其不同极性提取物及其分离组分在体内外模型中的作用差异、对NF-κB/AP-1（核因子κB/激活蛋白-1）信号通路的调控机制以及活性组分的化学特征仍需深入阐明。为此，本研究旨在系统评估黄花稔地上部分的三种提取物及来自活性提取物的分离组分在TPA诱导的小鼠耳水肿模型中的抗炎效果，通过组织形态计量学量化炎症损伤，并在RAW-Blue?细胞中测量TPA或LPS刺激下的NF-κB/AP-1驱动的SEAP报告基因活性，同时对活性组分进行初步的化学表征。
主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：首先，将黄花稔干燥地上部分依次用正己烷、乙酸乙酯和甲醇进行浸提，获得三种粗提物（SrHex、SrAcOEt、SrMeOH）。其次，利用硅胶开放柱色谱法对活性最强的正己烷提取物（SrHex）进行分级，采用正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，得到五个亚组分（H-F1至H-F5）。第三，使用雄性CF-1小鼠（来源于墨西哥PRONAVIBE，经SENASICA批准）建立TPA诱导的急性耳廓水肿模型，通过测定耳片重量差计算水肿抑制率。第四，对选定组别的耳组织进行苏木精-伊红（H&E）和Masson三色染色，使用ImageJ软件进行表皮/皮下组织厚度及胶原层厚度的形态计量学测量。第五，采用RAW-Blue?巨噬细胞衍生细胞系（含NF-κB/AP-1诱导型SEAP报告基因），分别以TPA或LPS作为刺激物，通过QUANTI-Blue?试剂检测SEAP活性，并结合MTT法评估细胞活力。最后，使用气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（GC-MS）对H-F3和H-F5馏分进行初步化学组成分析，通过与NIST质谱库比对鉴定化合物。
研究结果
3.1 提取物与馏分的得率
从1162克干燥黄花稔地上部分中，通过顺序提取获得了12克正己烷提取物（SrHex，得率1.03%）、83.2克乙酸乙酯提取物（SrAcOEt，得率7.16%）和176.62克甲醇提取物（SrMeOH，得率15.2%）。薄层色谱（TLC）分析表明SrHex及其馏分含有碳氢化合物、萜类、胆甾烷型化合物、萘醌类和羧酸酯类成分。
3.2 H-F3和H-F5馏分的化学鉴定
GC-MS分析提供了H-F3和H-F5馏分的初步化学组成。在H-F3中，主要鉴定出二氢猕猴桃内酯（一种降异戊二烯类化合物）、2-亚甲基-5α-胆甾烷-3β-醇和己二酸单（2-乙基己基）酯。在H-F5中，鉴定出环丙烷十四烷酸2-辛基甲酯（一种脂肪酸酯）和3′,8,8′-三甲氧基-3-哌啶基-2,2′-联萘-1,1′,4,4′-四酮（一种萘醌型化合物）。
3.3 黄花稔提取物和馏分对TPA诱导水肿模型的抗炎效果
TPA处理使模型对照组（VEH）的平均耳重差达到12.3毫克。阳性对照吲哚美辛（INDO）抑制了87.3%的水肿。SrHex和SrMeOH提取物分别显著抑制了69.6%和56.8%的水肿，而SrAcOEt无显著效果。来自SrHex的五个馏分均显著减少了水肿，其中H-F3活性最高，抑制率达77.06%，其他馏分抑制率分别为H-F1 58.4%、H-F2 62.8%、H-F4 53.3%和H-F5 42.5%。
3.4 黄花稔对TPA诱导耳水肿的组织学分析
组织学分析选取了SrHex及H-F1、H-F2、H-F3进行处理。这些处理不同程度地减轻了TPA引起的组织病理学改变，包括表皮和皮下组织增厚、炎性细胞浸润、真皮网状层紊乱、血管充血以及胶原层增厚。形态计量学结果显示，INDO、SrHex、H-F1、H-F2和H-F3均显著降低了表皮/皮下组织总厚度和胶原层厚度，其中H-F3的效果最接近吲哚美辛。
3.5 黄花稔对RAW-Blue?巨噬细胞衍生细胞的影响
3.5.1 对TPA刺激的RAW-Blue?巨噬细胞的影响：在TPA刺激下，SrHex（200和500 μg/mL）及其馏分H-F1、H-F2、H-F3（25、50、100 μg/mL）均未显著影响细胞活力。所有处理均显著降低了NF-κB/AP-1驱动的SEAP报告基因活性。其中，H-F3表现出最清晰的浓度依赖性抑制，在100 μg/mL时抑制率约达71%。
3.5.2 正己烷提取物对LPS刺激的RAW-Blue?巨噬细胞的影响：SrHex（125-800 μg/mL）在不影响细胞活力的前提下，浓度依赖性地显著抑制了LPS诱导的SEAP报告基因活性。在800 μg/mL时，抑制率达到约82%，与吲哚美辛相当。通过浓度-响应曲线估算的IC50为60.52 μg/mL，Emax为78.12%。
3.5.3 H-F1至H-F5馏分对LPS刺激的RAW-Blue?巨噬细胞的影响：H-F2、H-F3、H-F4和H-F5在25-800 μg/mL范围内均未显著影响细胞活力，并浓度依赖性地抑制了LPS诱导的SEAP活性。H-F1在低浓度（25、50 μg/mL）下有效且不影响活力，但在100-800 μg/mL时伴随显著的细胞活力下降，因此高浓度下的抑制效果需谨慎解读。基于IC50值，各馏分的表观效价排序为：H-F5（20.42 μg/mL）> H-F3（24.37 μg/mL）> H-F4（25.51 μg/mL）> H-F2（30.12 μg/mL）。H-F5同时展现出最高的最大抑制效应（Emax 98.04%）。
讨论与结论
本研究表明，黄花稔的正己烷提取物（SrHex）及其馏分在体内外模型中均展现出抗炎活性。讨论部分指出，TPA诱导的耳水肿模型能快速引发血管和组织改变、表皮增生、炎性细胞募集及细胞内炎症信号激活。通过矿物油对照和反向给药实验排除了脂溶性提取物作为物理屏障导致假阳性的可能性。组织学证据支持了宏观水肿减轻的结论，特别是H-F3在减少表皮/皮下组织厚度和胶原层厚度方面表现突出。在细胞层面，SrHex和H-F3在TPA刺激下有效抑制了NF-κB/AP-1驱动的SEAP活性，这与体内结果一致。在LPS刺激模型中，SrHex及各馏分（尤其是H-F5）展现了强大的浓度依赖性抑制效应，表明它们可能通过调节CD14/TLR4/MD-2受体复合物下游的信号通路发挥作用。值得注意的是，H-F3在TPA模型中活性最强，而H-F5在LPS刺激的细胞实验中效价最高，这种差异反映了不同馏分的作用依赖于炎症刺激类型和生物学环境。GC-MS初步鉴定的化合物为后续活性成分追踪提供了线索，但研究强调，这些化合物的具体贡献需要通过进一步的分离、结构确认和单独的药理评价来确定。研究的局限性包括：SEAP报告基因检测无法确定具体的分子靶点；不能完全排除可溶性植物化学物质对检测试剂的直接干扰；未进行皮肤渗透性和局部药代动力学评估；以及缺乏直接的机制研究如p65核转位、IκBα磷酸化及炎症介质（如TNF-α、IL-6、IL-1β、NO、PGE2、COX-2、iNOS）的检测。
结论：本研究验证了黄花稔的抗炎潜力，并证明其正己烷提取物包含具有不同药理特征的馏分。H-F3在多个模型中表现出一致的活性，能显著减轻TPA诱导的体内耳水肿、改善炎症组织学标志物，并抑制TPA驱动的NF-κB/AP-1 SEAP报告基因活性。相比之下，H-F5在对抗LPS诱导的NF-κB/AP-1激活中展现出最高的效价。这些不同的活性谱表明，黄花稔的抗炎作用并非由单一化合物介导，而是由化学性质不同的成分共同作用，其活性取决于炎症触发因素。在H-F3和H-F5中初步鉴定的化合物可能有助于这些效应，但确认其具体作用和分子机制需要分离单个代谢物并验证其直接靶点。
