脓毒症相关脑病小鼠皮层组织m6A甲基化与转录组谱的整合分析

《Journal of Inflammation Research》：Integrative Analysis of m6A Methylation and Transcriptomic Profiles in Cortical Tissues of Mice with Sepsis-Associated Encephalopathy

　　

背景 脓毒症相关脑病（SAE）是脓毒症患者常见且严重的并发症，以死亡率增加和认知功能障碍为特征。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是最普遍的RNA修饰之一，通过调控RNA代谢在中枢神经系统中发挥关键作用。然而，其在SAE发病机制中的作用尚未被探索。方法 研究人员采用RNA测序（RNA-seq）和甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-sequencing）分析脂多糖（LPS）诱导的脓毒症小鼠脑皮层的转录组谱和m⁶A甲基化。通过生物信息学分析鉴定m⁶A甲基化改变和差异表达的基因。进一步使用定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）验证靶基因和m⁶A调控因子。结果 脓毒症小鼠皮层组织中大量基因表现出差异表达和m⁶A修饰改变。基因功能富集分析显示，差异表达基因富集于免疫和炎症反应以及神经活性配体-受体相互作用相关通路，差异m⁶A修饰基因与神经退行性变、突触功能和代谢相关通路显著相关。对同时具有m⁶A甲基化改变和转录改变的基因进行综合分析，鉴定出数个与炎症过程高度相关的关键基因。验证实验证实，脓毒症小鼠皮层中数个靶基因（Ahsg、Alb、Apoa1、Serpina1b、Serpinf2和Serpina3K）及m⁶A调控因子（Mettl3、Mettl16、Igfbp1和Igfbp3）的mRNA水平显著失调。结论 本研究提供了脓毒症小鼠皮层组织m⁶A甲基化的全转录组分析，提示m⁶A介导的炎症基因表达调控与SAE发病机制相关。研究结果为脓毒症相关脑损伤机制和潜在治疗靶点提供了有价值的见解。

脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy，SAE）是脓毒症患者常见而严重的并发症，与死亡率升高和认知功能障碍相关。脓毒症源于系统性免疫反应，可导致多器官损伤，尤其脑损伤；约70%脓毒症患者出现从轻度认知障碍到昏迷的脑损伤，且即使治疗后仍可能有长期认知下降和神经退行性疾病风险增加。现有研究认为SAE发生与炎症反应过度激活有关，外周炎症介质和补体成分升高可破坏血脑屏障并引起过度神经炎症，小胶质细胞在中枢神经系统中介导神经炎症。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是丰富的RNA修饰，通过影响RNA剪接、转运、降解和翻译调控转录后基因表达，参与神经发育、神经可塑性和认知。已有临床和动物研究提示m⁶A与脓毒症及免疫介导器官损伤有关，但m⁶A在SAE相关认知功能障碍中的作用尚未见报道；且多数SAE研究聚焦海马，而临床和动物证据显示皮层也参与脓毒症神经炎症、神经功能障碍、认知损害及焦虑抑郁样行为。因此，研究人员对脂多糖（LPS）诱导脓毒症小鼠皮层进行m⁶A表观转录组和转录组整合分析，以探索SAE分子机制和潜在治疗靶点。研究结论是脓毒症小鼠皮层存在差异m⁶A甲基化模式和转录组谱，同时改变m⁶A甲基化和转录水平的基因参与炎症过程，提示m⁶A介导的炎症基因表达潜在联系可能参与SAE发病机制，为脓毒症相关脑损伤机制提供新见解。

研究方法概括：研究人员使用8–12周龄雄性C57BL/6小鼠（Jicui Pharmachem Biotechnology Co., Ltd.，中国），体重18–22 g，以腹腔注射LPS（Escherichia coli 0111:B4，10 mg/kg）建立SAE模型，对照组注射等体积PBS，注射后24 h采集皮层组织；开展新物体识别（NOR）、强迫游泳试验（FST）和开放场试验；对皮层组织进行RNA-seq和甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq），并进行差异表达、基因本体（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集及蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络等生物信息学分析；采用RT-qPCR、MeRIP-qPCR和酶联免疫吸附测定（ELISA）验证。

研究结果：1）LPS诱导的神经炎症和行为损害：通过LPS腹腔注射建立脓毒症模型并检测皮层炎症因子，发现IL-6和TNF-α mRNA显著升高，IL-1β不变，抗炎IL-10表达升高；ELISA证实TNF-α蛋白显著升高；NOR显示记忆受损，FST显示不动时间延长提示抑郁样行为，开放场试验运动活性无显著差异。2）小鼠皮层差异表达基因（DEGs）的功能富集分析：RNA-seq鉴定3128个DEGs（1451上调、1677下调）；上调基因富集于防御反应、免疫反应正调控、对细菌反应及细胞因子-细胞因子受体相互作用、EB病毒感染、单纯疱疹感染等通路；下调基因富集于smoothened信号通路调控、G蛋白偶联受体信号通路及神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、钙信号通路；PPI网络显示Tnf、Il6、Cxcl10为上调核心基因，Col1a1、Fos、H3c8为下调核心基因。3）脓毒症与对照小鼠差异m⁶A甲基化谱：MeRIP-seq共鉴定5930个共同m⁶A峰对应5543个基因转录本；m⁶A主要位于编码序列（CDS）和3′非翻译区（3′ UTR）；脓毒症组CDS甲基化略高（46.94% vs 44.99%），3′ UTR略低（36.49% vs 37.68%）；两组核心motif为GGACU，即m⁶A writer Mettl3结合位点motif；差异甲基化分析发现924个差异峰，683上调、241下调，对应571个高甲基化基因和209个低甲基化基因。4）差异甲基化基因（DMGs）的功能富集分析：高甲基化基因富集于RNA聚合酶II转录调控、染色质重塑及神经退行性变-多种疾病、Alzheimer病、脊髓小脑共济失调等通路；低甲基化基因富集于细胞分化、蛋白泛素化、对LPS反应及代谢通路、PI3K-Akt信号通路、视黄醇代谢；PPI显示Prkacb、Grin2b、Htt为m⁶A上调核心基因，Alb、Ugt2b1、Cyp3a11为下调核心基因。5）小鼠皮层DMGs与DEGs联合分析：综合鉴定63个同时改变mRNA表达和m⁶A甲基化的基因；Pearson相关分析显示m⁶A修饰水平与mRNA表达水平显著负相关，提示m⁶A修饰在SAE发病中可能对基因表达起抑制性作用；PPI网络显示7个关键基因构成单一互作网络：Ahsg、Alb、Apoa1、Apoa2、Serpina1b、Serpinaf2、Serpina3K，这些基因与炎症过程相关；IGV分析显示脓毒症小鼠中Ahsg等基因甲基化降低伴转录升高。6）脓毒症小鼠皮层关键基因和m⁶A调控因子表达改变：MeRIP-qPCR显示Ahsg、Alb、Apoa1、Serpina1b和Serpina3K甲基化水平降低；RT-qPCR证实Ahsg、Alb、Apoa1、Serpina1b、Serpinf2和Serpina3K mRNA显著升高；转录组分析显示writer基因Mettl3和Mettl16及reader基因Igf2bp3显著下调，reader基因Igfbp1和Igfbp3上调；RT-qPCR验证Mettl3、Mettl16下调而Igfbp1、Igfbp3上调。

讨论部分总结：研究人员指出脓毒症常累及中枢神经系统，导致神经损伤和认知功能障碍，且认知缺陷可长期持续并增加神经退行性疾病风险；m⁶A是重要转录后修饰，参与RNA稳定性和质量控制，已有研究显示m⁶A参与脓毒症多器官功能障碍，但尚无研究聚焦脓毒症脑组织m⁶A修饰。本研究发现上调mRNA主要富集于免疫和炎症反应相关通路，下调mRNA富集于神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt和钙信号通路；高甲基化基因富集于神经退行性变-多种疾病、Alzheimer病、脊髓小脑共济失调及突触相关通路，低甲基化基因富集于代谢通路、PI3K-Akt和视黄醇代谢。联合分析鉴定63个同时改变基因，PPI网络突出7个与炎症相关基因；验证显示Ahsg、Alb、Apoa1、Serpina1b和Serpina3K低甲基化且mRNA升高，这些基因编码的Fetuin-A、Albumin、Apoa1、Serpina1b和Serpina3K具有抗炎作用，Albumin、Serpina1b和Serpina3K也有神经保护作用。研究人员同时指出局限：仅使用LPS诱导雄性小鼠24 h模型，需在盲肠结扎穿孔（CLP）模型和性别差异中验证，并需后续研究长期神经认知下降及具体m⁶A调控因子和靶基因机制。研究结论翻译：综上所述，本研究揭示了LPS诱导SAE小鼠皮层与对照小鼠相比存在差异m⁶A甲基化模式和转录组谱改变；同时发生m⁶A甲基化和转录水平改变的基因参与炎症过程。研究结果提示m⁶A介导的炎症基因表达潜在联系可能在SAE发病机制中发挥作用，为脓毒症相关脑损伤的致病机制提供了新见解。