《Cell Reports》：AREG mediates transient hepatocellular carcinoma resistance to receptor tyrosine kinase inhibitors
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仑伐替尼（lenvatinib）是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的一线治疗药物，然而耐药性仍然是主要的临床挑战。新兴研究表明，耐药性是通过动态的多步骤过程演化的。在本研究中，研究人员利用多时间点、多组学采样，表征了HCC
仑伐替尼（lenvatinib）是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的一线治疗药物，然而耐药性仍然是主要的临床挑战。新兴研究表明，耐药性是通过动态的多步骤过程演化的。在本研究中，研究人员利用多时间点、多组学采样，表征了HCC细胞对仑伐替尼耐药的轨迹，并识别出以状态转变为标志的三个适应状态。多组学分析和功能验证确定了两性调节素（amphiregulin, AREG）在本研究模型中是一种关键的短暂耐药中介因子。AREG是一种充分且优势的配体，能够通过表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）激活促进细胞存活。对AREG-EGFR轴的药理学抑制可特异性靶向早期耐药细胞。此外，AREG上调在额外的平行实验和另一HCC细胞系中得到了验证。在机制上，染色体3p上的局灶性缺失可能促使NF-κB激活和AREG表达。本研究描绘了一种反复出现但短暂的适应机制，并提出了新的治疗机会——例如靶向短暂耐药机制的联合疗法——以预防或克服药物耐药。
**研究背景与意义**
肿瘤靶向药物耐药是限制靶向治疗长期疗效的主要障碍。既往研究已表明，肿瘤耐药的发展是一个复杂、动态且多阶段的过程，不同阶段可能激活不同的耐药机制，肿瘤细胞群体的异质性也随疾病进展持续演化。然而，耐药发展早期阶段所涉及的机制往往被忽视，而这些早期机制可能对癌细胞群体在获得后续更高效耐药改变之前的存活至关重要。
原发性肝癌是全球第四大癌症死亡原因，其中HCC占原发性肝癌病例的75%–85%。由于肝脏代偿功能强且肝癌细胞侵袭性高，多数患者确诊时已处于中晚期。对于不可手术的晚期HCC患者，多靶点酪氨酸激酶抑制剂仑伐替尼和索拉非尼是一线标准治疗，但其客观缓解率仅约24.1%和9.2%，且多数患者最终发生获得性耐药。尽管针对RTKi耐药已有广泛研究，但既往工作多集中于原发耐药预测因子、药物耐受持久态（drug-tolerant persister, DTP）以及长期药物暴露后的稳定耐药机制，对治疗早期阶段的动态演化过程仍缺乏系统了解。
为系统揭示RTKi耐药机制，特别是早期阶段的机制，研究人员采用逐步剂量递增策略建立了基于HCC细胞系的获得性仑伐替尼耐药进展模型，并整合多组学分析。研究发现，在仑伐替尼耐药的早期状态中，癌细胞瞬时过表达两性调节素（amphiregulin, AREG）蛋白以激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）信号通路，且该策略同样适用于其他RTKi（索拉非尼）。动物模型实验证实，将原药与靶向该短暂耐药机制的药物联用确实降低了耐药发生率。这一发现深化了对耐药动态过程的理解，为监测疾病进展提供了潜在生物标志物，并为降低或延缓患者耐药提供了新型联合治疗策略。
**主要技术方法**
研究人员使用Hep3B和Huh7 HCC细胞系，通过逐步剂量递增法构建获得性仑伐替尼耐药模型。研究采用多组学技术，包括单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）芯片、RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）、转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin using sequencing, ATAC-seq）、单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）、磷酸化蛋白质组质谱分析及全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）。功能验证实验包括细胞活力测定、Western blot、流式细胞术、双荧光素酶报告基因实验、免疫荧光染色及小鼠异种移植模型。队列数据来源于癌症基因组图谱肝细胞癌（TCGA-LIHC）及HRA001272公共数据集。
**研究结果**
**Hep3B细胞在仑伐替尼耐药过程中经历多个状态**
研究人员对三个独立生物学重复样本实施从3 μM至10 μM的剂量递增实验，收集不同耐药浓度下适应细胞群体。通过SNP芯片和RNA-seq分别在DNA和RNA水平聚类分析，三种重复均被划分为三个状态（state1、state2、state3）。增殖活性检测显示，Rep1和Rep3的增殖活性在耐药进化期间持续增加，最终在C10和C7.5恢复至野生型水平；Rep2则自始维持接近野生型的高增殖活性。状态1细胞虽然增殖较慢，但不显示MKI67降低或G0期阻滞，不符合经典DTP表型，且表现出全基因组范围的拷贝数改变。研究结论是，对仑伐替尼的渐进适应伴随细胞状态转变，增殖活性增强代表耐药表型增强，且该适应轨迹在生物学重复中保守。
**AREG高表达是仑伐替尼的短暂耐药机制**
研究人员对三个重复样本的转录组数据进行时间序列分析，将差异表达基因分为四个模块。基因集富集分析显示，在耐药早期状态（S1和S2）中"信号受体调节活性"显著上调。通过筛选状态1特异上调基因与信号受体调节活性基因集的交集获得九个配体，结合表达水平和受体表达分析，最终优先确定AREG-EGFR轴为候选救援机制。RNA和蛋白水平验证显示，AREG在早期状态特异性高表达，在野生型敏感细胞和状态3中不表达。在Huh7细胞的三次平行进化实验中，所有重复均在早期状态高表达AREG和EGFR。AREG中和抗体可部分使状态1细胞增敏，外源添加AREG蛋白可有效诱导敏感细胞对仑伐替尼和索拉非尼的耐药表型并促进增殖，且在生理相关低浓度（100 pg/mL）下即足以增强耐药。EREG虽同样上调但作用较弱。这表明AREG是状态1耐药中充分且优势的配体，以剂量依赖方式发挥作用。
**AREG通过激活EGFR信号通路介导耐药**
磷酸化蛋白质组学数据显示状态1细胞中EGFR信号和细胞周期相关磷酸化增强，EGFR Y1148和Y1173位点磷酸化水平显著升高，Western blot证实Y1068位点磷酸化及下游ERK1/2磷酸化增强。EGFR抑制剂实验显示，状态1细胞显著比状态3细胞更敏感，且在EGFR抑制剂作用下增殖可被完全抑制。在野生型细胞中，AREG蛋白补充可显著缓解仑伐替尼诱导的存活抑制，而EGFR抑制剂厄洛替尼可有效逆转此效应。小鼠异种移植模型显示，仑伐替尼与厄洛替尼联合方案显著抑制肿瘤生长、延缓耐药发生并提高荷瘤鼠生存率。内皮细胞实验表明，HUVEC对仑伐替尼敏感，但外源AREG不能赋予其耐药，机制上与其缺乏EGFR表达有关。上述结果表明AREG通过激活EGFR信号通路介导仑伐替尼耐药，且不损害仑伐替尼对内皮细胞的抗血管生成作用。
**NF-κB通路在状态1介导AREG表达**
研究人员整合TCGA-LIHC队列的RNA-seq和ATAC-seq数据分析AREG的潜在转录调控因子，NF-κB转录因子基序在AREG高表达肿瘤样本中富集最显著。在AREG高表达的状态1细胞中，NF-κB信号通路活性显著上调而状态3中不上调。NF-κB抑制剂QNZ可完全抑制状态1细胞的AREG蛋白产生，双荧光素酶报告实验证实状态1细胞NF-κB转录活性显著高于状态3。状态1细胞对QNZ高度敏感而状态3细胞耐受。研究还排除了芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AHR）在状态1中调控AREG的可能性，表明短暂耐药状态与稳定耐药状态受不同机制调控。
**scRNA-seq揭示异质性克隆结构和动态耐药进化过程**
单细胞RNA-seq分析显示Rep1-C3（状态1）存在两个细胞聚类、Rep1-C4.5（状态2）存在三个聚类，表明耐药细胞内存在显著克隆异质性。AREG高表达聚类（cluster2和cluster4）显示显著升高的NF-κB和EGFR信号活性，AREG表达与NF-κB通路活性及EGFR信号活性均呈正相关。进化关系分析显示，AREG高表达聚类在不同时间点具有高相似性，而AREG低表达聚类聚在一起。AREG高表达细胞比例在状态2显著下降（从96.8%降至1.4%），解释了整体水平上观察到的AREG瞬时上调特征。
**染色体3p局灶性缺失与NF-κB激活和AREG表达相关**
研究人员利用差异表达表面蛋白TM4SF1作为分选标志，通过荧光激活细胞分选分离AREG高/低表达亚群并进行DNA测序，同时使用inferCNV从scRNA-seq数据推断拷贝数变异，并在TCGA-LIHC队列中拟合拷贝数改变与AREG表达的线性模型。三种独立方法共同鉴定出唯一一个与AREG高表达相关的染色体3p缺失区域。TCGA数据分析显示，该区域发生局灶性缺失的样本具有显著更高的AREG表达，并伴随NF-κB和EGFR信号活性升高。这表明染色体3p缺失可能有助于NF-κB激活和AREG高表达。
**临床意义：AREG与RTKi耐药及预后**
在索拉非尼治疗的HCC患者中，血浆AREG水平在治疗后较基线显著升高。在TCGA-LIHC和HRA001272两个独立队列中，AREG高表达均与较差的总生存期显著相关。这些临床观察结果与AREG在HCC进展和治疗耐药中的潜在作用一致。
**总结讨论与研究结论**
本研究表明，在HCC体外逐步剂量递增模型中，AREG介导的短暂耐药是一种常见且可靶向的适应状态。在大多数平行实验中，早期AREG上调高频出现（6个Hep3B重复中有5个，3个Huh7重复全部），表明该信号机制可能是HCC耐药进化中的高频适应策略。状态1细胞虽表现出衰老相关表型，但不完全符合经典DTP状态特征，其基因组发生广泛改变且未出现G0期阻滞。NF-κB被确定为状态1中调控AREG表达的关键转录因子，与衰老相关分泌表型中NF-κB的作用一致。染色体3p缺失作为多种癌症中反复出现的染色体改变，可能通过持续DNA损伤信号和氧化应激等途径促进NF-κB激活。及时联合EGFR抑制剂干预可能阻断这一存活轴，从而延缓或防止不可逆稳定耐药的发生。
需要指出的是，本研究结果完全基于体外逐步剂量递增方案，该方案虽能捕获HCC耐药进化中的中间状态，但无法完全重现患者体内肿瘤所经历的药物暴露条件（包括脉冲式稳态药物暴露和肿瘤微环境的影响）。由于临床样本通常在治疗前或影像学疾病进展时采集，获得耐药瞬时阶段的纵向样本仍具挑战性。因此，AREG介导的短暂耐药是否在患者肿瘤进化中发生，以及是否构成肿瘤从药物敏感向稳定耐药转变的必经中间状态，仍需未来结合临床样本和纵向患者数据的研究加以证实。总体而言，该策略并非在耐药已经确立后进行干预，而是对药物敏感肿瘤细胞向稳定耐药进展的进化轨迹进行早期干预，为精准治疗提供了新视角。
**研究结论**：研究人员通过逐步剂量递增模型和多组学分析，证明了AREG介导的短暂耐药是HCC对RTKi耐药进化过程中的一种常见且可靶向的适应状态，NF-κB是调控该过程中AREG表达的关键转录因子，染色体3p局灶性缺失可能参与NF-κB的激活。在体外和体内模型中，靶向AREG-EGFR轴均能有效逆转早期耐药。这些发现提示，及时联合EGFR抑制剂进行干预，可能通过阻断早期存活机制来延缓或防止稳定耐药的发生，为预防和克服临床耐药提供了潜在的联合治疗策略。
