基于论文摘要，建议采用如下中文标题： 己糖激酶2（HK2） moonlighting 功能作为STING介导天然免疫的负调控因子

《Cell Reports》：Hexokinase-2 moonlights as a suppressor of STING-mediated innate immunity

　　

代谢酶因其在初级代谢功能之外所发挥的“兼职”（moonlighting）功能而日益受到关注。尽管此类非经典活性在肿瘤生物学中已被充分表征，但其在天然免疫中的作用仍缺乏明确界定。本研究表明，己糖激酶II（Hexokinase II，HK2）——糖酵解途径的限速酶——能够以不依赖于其酶活性的方式抑制STING介导的天然免疫应答。在STING激活后，活性氧（reactive oxygen species，ROS）触发HK2从线粒体解离并转位至细胞质。胞质中的HK2随后与STING相互作用，阻碍其寡聚化及向高尔基体的转位，从而削弱下游免疫信号。值得注意的是，HK-TAT——一种可诱导HK2从线粒体释放的肽段——能够有效抑制STING依赖性免疫激活，并在STING驱动的自身免疫小鼠模型中改善疾病表型。上述发现揭示了HK2作为STING信号负调控因子的兼职功能，并为治疗由STING失调驱动的自身免疫性疾病提供了潜在的治疗策略。

论文解读：己糖激酶2（HK2）通过 moonlighting 功能负调控STING介导的天然免疫信号

一、研究背景与科学问题

代谢酶长期以来被视为细胞生物合成与能量代谢的核心执行者。然而，越来越多的证据表明，这些酶还具备超越其经典代谢活性的非经典“兼职”（moonlighting）功能，尤其在肿瘤生物学中，此类功能可调控肿瘤细胞存活与进展所必需的多项细胞活动。例如，糖酵解酶丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）可独立于其代谢活性调控转录、自噬及免疫应答。己糖激酶II（Hexokinase II，HK2）作为糖酵解的第一个限速酶，同样被证实具有超越葡萄糖磷酸化的多功能调控作用。例如，在胶质母细胞瘤细胞中，Warburg效应特征性的糖酵解通量增加可触发HK2从线粒体解离，并促进其与胞质IκBα结合，进而磷酸化IκBα导致其降解并激活NF-κB，最终上调PD-L1等免疫检查点分子，促进脑肿瘤免疫逃逸。此外，核内HK2可独立于其己糖激酶活性与MAX及SIRT1相互作用，维持急性髓系白血病细胞的干性与DNA损伤修复能力。尽管HK2依赖性葡萄糖代谢已被证明与抗病毒天然免疫密切相关，但HK2是否直接且独立于其经典代谢活性调控天然免疫信号，仍缺乏系统研究。

cGAS-STING（环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子）通路是天然免疫应答胞质DNA的关键信号轴。cGAS识别胞质DNA后合成环状GMP-AMP（cyclic GMP-AMP，cGAMP），cGAMP作为第二信使结合并激活定位于内质网（endoplasmic reticulum，ER）的STING。STING随后发生寡聚化并从ER转位至高尔基体，激活下游信号级联，驱动I型干扰素和促炎细胞因子的产生。STING通路的适时适度激活对抵御微生物病原体和肿瘤监视至关重要，但其失调可导致病理后果。例如，STING功能获得性突变（如人STING N154S，对应小鼠N153S）可导致婴儿期起病的STING相关血管病变（STING-associated vasculopathy with onset in infancy，SAVI）；TREX1缺陷导致异常胞质DNA积累和STING过度激活，驱动Aicardi-Goutières综合征等病理过程。另一方面，病毒和肿瘤已进化出复杂策略操纵STING信号以促进免疫逃逸。鉴于代谢酶moonlighting功能的不断涌现，阐明代谢酶是否及如何通过非经典兼职功能调控天然免疫，不仅有助于深入理解病原体和肿瘤的新型免疫逃逸策略，也可能为相关自身免疫病的治疗提供新策略。

二、研究内容与主要结论

该研究揭示了HK2作为STING介导天然免疫信号负调控因子的先前未被识别的moonlighting功能。研究表明，STING激活后ROS产生增加，促进HK2从线粒体解离至胞质，胞质HK2直接与STING相互作用，阻碍其寡聚化及高尔基体转位，从而抑制下游免疫信号。该免疫功能独立于HK2的糖酵解酶活性。进一步研究发现，能够强制HK2从线粒体释放的肽段HK-TAT在Trex1缺陷和STING N153S两种自身免疫小鼠模型中均能有效抑制STING驱动的自身免疫反应，为STING相关自身免疫病提供了机制上独特的治疗策略。

三、主要关键技术方法

研究人员主要运用了以下关键技术方法：细胞组分分离与免疫印迹（immunoblotting）分析HK2亚细胞定位变化；邻近连接分析（proximity ligation assay，PLA）检测HK2与VDAC1及HK2与STING的胞内相互作用；CRISPR-Cas9基因敲除技术构建HK2及STING敲除细胞系；体外线粒体HK2结合实验验证氧化修饰对HK2线粒体锚定的影响；蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Blue Native PAGE，BN-PAGE）分析STING寡聚化；免疫荧光共定位分析STING从内质网到高尔基体的转位；流式细胞术检测活性氧水平及免疫细胞亚群；骨髓嵌合小鼠模型（来源于Trex1^-/-或Sting^N153S/WT供体小鼠）结合肽段治疗评估体内疗效。

四、研究结果

1. STING激活诱导ROS依赖性HK2从线粒体解离

研究人员发现，HSV-1感染、胞质DNA（HT-DNA）刺激及STING激动剂diABZI处理均可促进HK2从线粒体转位至胞质，同时伴随ROS产生增加。线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO可逆转HSV-1诱导的HK2转位。ROS诱导剂甲萘醌同样可触发HK2转位，且可被Mito-TEMPO逆转。PLA分析显示，STING激活破坏HK2与VDAC1的相互作用，而Mito-TEMPO可恢复该相互作用。体外线粒体HK2结合实验进一步证实，温和H₂O₂处理分离的线粒体可显著降低其招募重组HK2的能力，且未检测到细胞色素c释放，排除了线粒体外膜通透化的影响。上述结果表明，STING激活过程中产生的ROS损害HK2与线粒体的结合，从而促进HK2从线粒体向胞质转位。

2. HK2以不依赖其己糖激酶活性的方式抑制cGAS-STING信号

在HeLa细胞中敲除HK2可增强HT-DNA诱导的ISG56和CXCL10表达及TBK1和IRF3磷酸化，而该增强效应在STING敲除细胞中消失。回补野生型HK2或催化失活突变体（D209A/D657A）均可抑制HT-DNA诱导的免疫应答，表明HK2的抑制作用独立于其己糖激酶活性。在原发性小鼠肺成纤维细胞（murine lung fibroblasts，MLFs）中，HK2缺陷同样增强HT-DNA和HSV-1诱导的天然免疫应答，包括TBK1/IRF3磷酸化及NF-κB下游基因（Tnf、Cxcl1）表达。在STING缺陷细胞中敲除HK2无增强效应，进一步确认HK2作用于STING通路。

3. HK2与STING相互作用以抑制STING介导的天然免疫

免疫共沉淀实验证实HK2与STING在HeLa细胞中组成性结合。STING第2位脯氨酸（P2）突变（P2A） abolished其与HK2的结合。在Sting敲除MLFs中回补STING-P2A突变体后，敲除HK2不再增强HT-DNA或HSV-1诱导的免疫应答，表明HK2与STING的结合对其免疫抑制功能至关重要。结构域映射实验显示，HK2的ΔN16突变体、N端结构域（1-464 aa）和C端结构域（465-917 aa）均保留STING结合能力。在较弱的人泛素C（UBC）启动子驱动下，ΔN16突变体比全长HK2表现出更强的免疫抑制活性，支持线粒体锚定破坏增强HK2抑制功能的观点。AlphaFold 3结构预测提示STING N端肽段（1-16 aa）插入HK2的两个催化口袋。

4. HK2靶向STING并阻断其寡聚化

HK2敲除不影响HT-DNA诱导的cGAMP产生，排除其对cGAS酶活性的影响。绕过cGAS直接使用cGAMP或diABZI激活STING后，HK2敲除细胞中免疫基因表达及TBK1/IRF3磷酸化显著增强。BN-PAGE分析显示，HK2敲除显著增强cGAMP和diABZI诱导的STING寡聚化，而回补野生型HK2或催化失活突变体均可抑制该效应。免疫荧光分析表明，HK2回补显著延迟STING从内质网到高尔基体的转位。这些数据表明HK2靶向STING，通过阻断其寡聚化和转位抑制STING介导的天然免疫应答。

5. HK-TAT肽通过诱导HK2从线粒体解离有效抑制STING驱动的免疫激活

HK-TAT肽通过破坏HK2与VDAC1的结合使HK2从线粒体释放至胞质。PLA分析证实HK-TAT处理降低HK2与VDAC1的相互作用并增强HK2与STING的结合。HK-TAT处理显著抑制HeLa细胞和MLFs中胞质DNA及HSV-1诱导的天然免疫应答，且该抑制作用依赖于HK2的存在。HK-TAT不影响IFN-β诱导的ISG54和ISG15表达，表明其不广泛抑制I型干扰素应答基因表达。HK-TAT处理显著抑制diABZI诱导的STING寡聚化及TBK1/IRF3磷酸化，且在回补催化失活HK2突变体的细胞中仍有效，表明其免疫抑制活性不依赖HK2己糖激酶活性。

6. HK-TAT治疗改善Trex1缺陷小鼠的自身炎症性疾病

在Trex1^-/-骨髓嵌合小鼠模型中，HK-TAT治疗显著防止体重下降并显著改善生存率（约89%治疗小鼠存活超过三个月），而对照组小鼠在51天内全部死亡。HK-TAT治疗显著改善脾肿大，减轻肾脏和肺部的免疫细胞浸润和组织损伤，抑制脾脏、脑和肝脏中IFN和细胞因子（Il12p40、Ifnb1、Ifna4）表达，并降低血清IL-1β、IFN-β和CCL5水平。流式细胞术分析显示，HK-TAT治疗增加naive CD4⁺和CD8⁺ T细胞频率，降低效应T细胞频率，减少表达颗粒酶B或IFN-γ的活化CD8⁺ T细胞比例，并降低生发中心B细胞频率，表明HK-TAT显著恢复免疫细胞稳态。

7. HK-TAT治疗改善SAVI小鼠模型的自身炎症性疾病表型

在STING^N153S骨髓嵌合SAVI小鼠模型中，HK-TAT治疗显著减轻体重下降，其疗效与共价STING抑制剂H-151相当。两种治疗均显著改善脾肿大，减轻肾脏和肺部炎症病变，降低血清IL-1β和IFN-β水平，并抑制肝脏、脾脏和脑中Il12p40、Ifnb1和Ifna4的表达。流式细胞术分析显示，与H-151类似，HK-TAT减少炎性髓系细胞（中性粒细胞和巨噬细胞）积累，增加CD4⁺和CD8⁺ T细胞频率，伴随naive T细胞增加和效应T细胞减少，并降低GrzmB⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞及生发中心B细胞频率。

五、讨论与结论

该研究揭示了HK2作为STING介导天然免疫负调控因子的先前未被识别的moonlighting功能。STING激活诱导的ROS产生促进HK2从线粒体转位至胞质，胞质HK2直接结合STING并阻碍其寡聚化和激活。该免疫抑制功能独立于HK2的糖酵解酶活性。研究还发现，STING在基础条件下作为细胞内在代谢检查点限制HK2依赖性有氧糖酵解，而激活的STING则通过HK2介导的负反馈防止过度免疫激活，这两种调控机制在不同生理背景下发挥作用。在治疗方面，HK-TAT肽通过动员HK2的内源性抑制功能抑制STING信号，在两种STING驱动的自身免疫模型中均表现出与H-151相当的疗效，代表了一种机制上独特的STING抑制策略。然而，肽类药物的稳定性、组织递送、药代动力学及重复给药需求可能限制其转化应用，未来需要进一步优化肽段稳定性与递送方式，并进行系统的药代动力学和安全性研究。此外，选择性破坏HK2-VDAC1相互作用的小分子可能为临床转化提供更可行的药理学途径。该研究扩展了对代谢酶moonlighting功能在天然免疫中作用的理解，并为STING相关自身炎症性疾病提供了新的治疗策略。