基于位点特异性整合哺乳动物展示平台的种系来源全长IgG支架靶向CDR-H3多样化从头分离抗原结合抗体：一项原理验证研究

《Antibodies》：De Novo Isolation of an Antigen-Binding Antibody by Targeted CDR-H3 Diversification of a Germline-Derived Scaffold in a Site-Specifically Integrated Mammalian Display Platform: A Proof-of-Principle Study

　　

背景/目标：哺乳动物展示可直接筛选全长IgG抗体，但遗传可控的文库构建仍具技术挑战。在此，研究人员开发了一个哺乳动物展示平台：首先在确定的人类人工染色体（HAC）受体位点建立靶标非经免疫的ΔDH抗体支架，然后通过CRISPR-Cas9介导的同源定向修复（HDR）将CDR-H3多样性直接引入该固定基因组背景。方法：通过Cre介导重组生成携带HAC上ΔDH支架的位点特异性整合展示细胞系。将随机化CDR-H3文库通过HDR导入该确定基因组背景，并利用磁激活和荧光激活细胞分选以及正交抗原检测形式进行筛选。分离克隆的结合特性通过流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）表征。结果：尽管早期选择富集了与荧光试剂而非目标抗原反应的克隆，优化选择方案后分离出AFFVVF。该选定抗体变体通过流式细胞术识别多个SARS-CoV-2受体结合域（RBD）变体，未检测到与无关抗原结合。作为重组蛋白，AFFVVF通过ELISA结合JN.1和XEC刺突三聚体，但不结合单体RBD，包括用于选择的XEC RBD，表明细胞法和板法检测中识别的抗原形式不同。针对表皮生长因子受体（EGFR）和糖蛋白A33（GPA33）的探索性选择也产生抗原依赖性群体偏移和离散序列变体富集，尽管单个候选物未作为重组抗体独立验证。结论：这些结果提供原理验证：在预先建立、遗传确定、靶标非经免疫的全长IgG支架内靶向CDR-H3多样化，可不从预先存在的抗原特异性抗体或库出发，产生新的抗原结合抗体。

研究背景与问题：抗体是治疗药物中快速扩展的一类，其发现通常包括抗原特异性结合物发现及后续亲和力、特异性和可开发性优化。体外展示可容纳大文库，但多先筛选scFv或Fab等片段并需重格式化；体内免疫受免疫耐受限制，尤其对自身抗原或宿主与靶物种高度保守抗原。哺乳动物展示可在哺乳动物细胞环境中直接筛选全长IgG，并早期评估表达等性质，但传统方法受整合位点、拷贝数和表达水平差异影响，基因组工程文库仍较小且构建技术难度高。位点特异性整合和基因组编辑可降低表达异质性，但直接在一个遗传确定、靶标非经免疫的全长IgG支架上生成并筛选CDR-H3多样性仍相对未充分探索。CDR-H3在序列、长度和结构上高度多样并位于抗原结合位点中心，研究人员据此设计ΔDH支架并假设广泛多样化CDR-H3可从未免疫支架产生新抗原结合特异性。

研究人员开展了以下研究并得出初步结论：建立HAC位点特异性整合的ΔDH全长IgG展示细胞系，通过CRISPR-Cas9介导HDR在固定基因组背景中引入随机CDR-H3，结合磁激活细胞分选（MACS）和荧光激活细胞分选（FACS）及正交抗原检测进行筛选；以SARS-CoV-2 RBD为模型抗原分离AFFVVF，并在EGFR和GPA33探索性筛选中观察到抗原依赖性富集。研究证明该平台可不依赖预先存在抗原特异性抗体或免疫库，从遗传确定的全长IgG支架获得新抗原结合抗体，但复杂编辑结果、序列依赖性表达和有限采样多样性仍是限制。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员以HEK293T（RCB2202，RIKEN BioResource Research Center）及由Y. Kazuki实验室提供的CHO21-HAC2来源21HAC2构建HAC/293T细胞，通过Cre-loxP将ΔDH抗体表达盒整合至HAC acceptor site，建立HAC/293T-ΔDH展示细胞系；该细胞系未存入公共细胞库。随后用Cas9核糖核蛋白复合物和单链寡脱氧核苷酸供体，经HDR在CDR-H3引入6NNB、10NNB或CX4C随机序列；以MACS/FACS筛选表面IgG及抗原结合群体，采用流式细胞术、ELISA及短/长扩增子二代测序（NGS）分析序列组成、克隆富集和疏水性。

研究结果：
3.1 确定哺乳动物抗体展示支架的设计与建立：通过Cre-loxP将基于IGHV3-23/IGHJ4与IGKV3-20/IGKJ1的ΔDH支架整合至HAC/293T，流式筛选和HPRT连接PCR确认强且较均一的表面IgG克隆HAC/293T-ΔDH，作为后续CDR-H3编辑亲本。
3.2 靶向插入确定CDR-H3序列可恢复抗原结合：将4个与种系背景匹配的已知抗SARS-CoV-2 CDR-H3经Cas9/ssODN插入，PCR确认插入；流式显示P3E6编辑群体抗原双阳性由1.85%经一轮富集升至78.2%，接近阳性对照NT193，而A0066、A0204、C0412仍低，说明合适CDR-H3可在该支架恢复结合并被展示选择富集。
3.3 随机6NNB库小规模筛选获得Alexa Fluor 647反应性克隆：6NNB编辑后经表面IgG富集和SARS-CoV-2 Alpha刺突筛选，结合阳性群体上升，但无关抗原和抗原免费对照背景亦高；换用PE/Dazzle 594抗His抗体后信号降至亲本水平；NGS显示LFVSVS富集至74.7%，ELISA显示其结合Alexa Fluor 647偶联抗His及同型对照，说明富集为检测试剂依赖而非目标抗原特异。
3.4 优化CDR-H3插入并富集表面IgG阳性库成员：比较Cas9、gRNA、ssODN比例和脉冲程序，EP1条件对281 bp插入产物富集最强；分选后非终止10NNB序列由66.29%升至96.25%，但仅约5–10%细胞保持亲本样表面IgG，说明HDR后需物理分选且短扩增子分析不足以解释表达丢失。
3.5 长扩增子测序识别短扩增子未解析的编辑产物：对全长抗体编码区NGS显示，仅12.70% reads为无随机区外氨基酸改变且无内部终止的完整10NNB插入，部分/其他长度插入占58.45%、缺失占19.57%，另有8.73%无法定位；部分符合短读长标准的序列仍主要见于中/阴性表达群体，说明完整阅读框和无终止不足以预测表面IgG表达。
3.6 大规模6NNB筛选产生XEC RBD反应群体：对9.6×10⁷细胞编辑，MACS富集表面hIgG-Fc后以XEC RBD进行MACS/FACS多轮筛选；第二轮分出3rd-high和3rd-low，3rd-high存在明显抗原非依赖/试剂依赖结合；3rd-low改用生物素化抗原/APC-streptavidin后XEC RBD阳性25.6%而抗原免费0.53%，后续富集至67.6%对0.23%，获得抗原依赖群体。10NNB平行筛选仅见较小差异。
3.7 NGS追踪显示6NNB库向AFFVVF渐进收敛：观察到的独特CDR-H3序列数在第一轮后升至9131，随后下降至最终少于100；3rd-high由PFTTVS和LFFVVS主导，LFFVVS与试剂反应克隆LFVSVS仅两残基不同；3rd-low换检测后PFWMVA和CRYYYS未保留，AFFVVF在第五轮占94.7%；读段加权Kyte–Doolittle疏水性均值升至2.99。
3.8 AFFVVF识别多个SARS-CoV-2 RBD变体且与刺突三聚体结合呈检测依赖：流式显示AFFVVF结合Alpha、Delta、Omicron、BA.5、EG.5.1、JN.1和XEC RBD，阳性率61.1%–86.6%，对EGFR、GPA33、CD19、HER2、流感HA无高于背景结合；重组AFFVVF经ELISA结合JN.1和XEC刺突三聚体，JN.1三聚体EC₅₀为389 ng/mL，后续平行板XEC与JN.1三聚体EC₅₀分别为1223/816和790/927 ng/mL，但不结合单体RBD；XEC RBD经生物素/APC-streptavidin复核阳性47.8%，抗原免费0.61%、生物素化CD19 0.39%，亲本ΔDH 0.95%，说明细胞展示与板式ELISA识别的抗原形式不同。
3.9 针对EGFR和GPA33筛选产生抗原依赖富集群体：以6NNB、10NNB和CX4C库探索筛选，流式显示EGFR和GPA33抗原浓度依赖性群体偏移；Sanger或克隆测序回收离散序列，如EGFR的CDFFSC、QCFMNFCL、VCATDGCE，GPA33的CALLLPKYGYFDY、SVSCAT、AYFMMS、VCWWVC、CARSYFDY、FCTPARCL、LCLVATCS等；但这些克隆未作为重组抗体独立验证，仅为候选；部分GPA33序列来自ΔDH桥接序列的缺失/插入而非设计插入。

讨论总结：该平台将展示盒建立与文库多样化分离，使库成员共享整合位点和表达结构，并因全程以全长IgG筛选而避免片段重格式化不确定性。但“遗传确定”仅指确定acceptor site的位点特异整合及共同遗传背景，研究未验证拷贝数或排除额外整合；CDR-H3-only多样化受固定框架、其余CDR和轻链兼容性限制；NNB理论多样性不等于实际生成并展示的库，短扩增子会高估结构完整抗体等位基因，长扩增子揭示复杂编辑产物，CDR-H3序列本身也影响展示；功能库复杂度不能由观察独特序列数可靠估计，理论细胞上限也因重复而可能高估。早期筛选出现试剂反应性克隆，说明需交替检测格式并设抗原免费和无关抗原对照。AFFVVF证明可从随机ΔDH系统获得新抗原结合变体，但来自单一库构建和选择轨迹，未测亲和力，未证明独立重复可重现；细胞展示与ELISA结合模式不同，单体RBD结合仍需无标记方法正交确认；后期疏水性升高不证明抗原特异性，需评估多特异性和可开发性。EGFR和GPA33仅显示抗原依赖富集，未验证抗原特异性；部分 scaffold-derived 变体提示需独立重组验证。总体局限包括复杂编辑结果、序列依赖性表达、实验采样多样性有限和检测试剂结合物富集；未来需改进编辑保真、库结构和选择设计，并以重组表达和结合验证推动从已知抗体优化走向全长IgG从头发现。

研究结论翻译：本研究建立了一个遗传确定的哺乳动物展示平台，在该平台中将CDR-H3多样性直接引入预先建立、位点特异性整合的全长IgG支架，并通过迭代选择进行筛选。利用该系统，研究人员分离出AFFVVF，这是一种先前未定义的抗原结合抗体，可识别多个SARS-CoV-2 RBD变体，且不需要预先存在的抗原特异性结合物。研究人员还在针对EGFR和GPA33的两个额外靶标的探索性选择中观察到抗原依赖性富集，所回收序列仍为候选物，尚待重组验证。这些结果为通过预定哺乳动物IgG支架内CDR-H3多样化进行从头结合物生成提供了原理验证，而非从头抗体发现的普遍证明。复杂基因组编辑结果、序列依赖性抗体表达和实验采样多样性有限仍是未来工作需要解决的重要限制。