优化疏水氨基酸修饰的六组氨酸与贝伐珠单抗的共组装，以实现角膜新生血管的近乎完全抑制

《Acta Biomaterialia》：Optimizing the co-assembly of hydrophobic amino acid-modified hexahistidine and bevacizumab for near-complete inhibition of corneal neovascularization

　　

摘要

角膜新生血管（CorNV）是导致失明的重要原因之一，全球有数百万人受到影响。抗血管生成抗体贝伐珠单抗（Beva）因其特异性和低副作用而在治疗CorNV中展现出潜力，但受限于角膜组织屏障，需要侵入性给药方式。这促使研究人员通过调节纳米粒子（NPs）的理化性质来改善角膜穿透性，开展了大量研究。本文提出了一种创新策略，即将六组氨酸（His6）与多种疏水性氨基酸（缬氨酸（V）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）和异亮氨酸（I））进行修饰后，与Beva共自组装形成XHmA@Beva NPs（VHmA@Beva、WHmA@Beva、YHmA@Beva和IHmA@Beva），旨在实现Beva的非侵入性、高效递送，以治疗CorNV。体外实验显示，所有XHmA@Beva NPs均能抑制管状形成和细胞迁移，抑制效果排序为：IHmA@Beva > YHmA@Beva > WHmA@Beva ≈ VHmA@Beva。在碱烧伤大鼠CorNV模型中，VHmA@Beva未能抑制新生血管生成，WHmA@Beva表现出微弱的抑制效果。值得注意的是，IHmA@Beva和YHmA@Beva由于其较长的眼部滞留时间和改善的角膜穿透性，显示出显著的新生血管抑制作用，其中IHmA@Beva实现了近乎完全抑制CorNV的效果。这些发现强调了疏水性氨基酸残基在肽纳米粒子组装中对跨生物屏障递药的至关重要作用，为CorNV的非侵入性治疗提供了新策略。

意义声明

角膜新生血管（CorNV）是导致眼前段失明的主要原因之一，每年全球有数百万患者受到影响。尽管贝伐珠单抗（Beva）等抗VEGF抗体药物在抑制新生血管生成方面具有高度有效性，但由于眼表的多重屏障，非侵入性给药仍面临巨大挑战。目前的非侵入性给药策略仅能实现约90%的抑制率，不足以进行临床转化。在本研究中，我们开发了一种基于Beva-肽-锌离子组装体的非侵入性给药方法，通过调节肽末端疏水性氨基酸，产生了一系列XHmA@Beva颗粒。其中，IHmA@Beva在大鼠碱性角膜损伤模型中几乎完全抑制了CorNV，代表了迄今为止抗VEGF抗体非侵入性递送的最佳结果。本研究不仅克服了抗体眼表非侵入性递送的效率限制，还展示了IHmA@Beva作为安全有效的临床转化策略的潜力，为CorNV提供了治疗途径。

引言

由创伤、炎症、感染或其他病理状况引起的角膜新生血管（CorNV）已成为影响全球超过百万患者的重要问题，尤其是患有糖尿病和心血管疾病等慢性病的患者[1]。CorNV的病理特征是新生血管不规则生长并侵入透明且无血管的角膜，这是角膜相关失明的主要原因之一[2,3]。目前，CorNV的临床管理通常采用小分子药物，如类固醇、抗生素和抗炎药物[[4], [5], [6]]。然而，包括贝伐珠单抗（Beva）和雷珠单抗在内的抗血管生成生物制剂，由于其高效性、特异性和极少的副作用，已成为有前景的替代方案[7]。尽管如此，这些蛋白质药物的大分子尺寸和亲水性阻碍了其穿透角膜屏障的能力，通常需要侵入性的结膜下注射，导致患者依从性差[8,9]。因此，开发这些抗血管生成生物制剂的非侵入性眼药水递送系统，是推进蛋白质药物在CorNV治疗中应用的关键途径，但这一目标仍然面临巨大挑战。

角膜由上皮、基质、Descemet膜和内皮组成，由于其复杂的结构和生理功能，构成了药物递送的自然屏障。特别是上皮层具有紧密连接，限制了药物通过细胞间隙的渗透[10]。因此，穿越角膜上皮的主要途径是跨细胞和旁细胞途径，其中旁细胞途径由于紧密连接的存在而受到显著限制[11]。近年来，基于纳米粒子（NPs）的药物递送策略备受关注，利用NPs的细胞摄取特性，通过跨细胞途径穿透角膜上皮[12]。各种类型的NPs，包括脂质体和两亲性聚合物胶束，已被广泛研究用于包封抗血管生成生物制剂，治疗角膜或视网膜新生血管[13,14]。我们近期的工作探索了一种基于六组氨酸（His6）与Beva在锌离子（Zn2+）存在下共自组装的递送系统（HmA@Beva）[15]。该方法具有温和的组装条件，能有效保留Beva的生物活性，实现高药物载药量和包封效率，从而提高药物治疗浓度并最小化载体材料潜在的安全风险[16]。通过延长眼部滞留时间、提高细胞摄取效率和增强溶酶体逃逸能力，HmA@Beva展现了卓越的CorNV治疗效果[[17], [18], [19]]。尽管上述研究在非侵入性方法抑制CorNV方面取得了显著进展，但报道的最高抑制率约为90%，距离预期的临床转化仍有较大差距[20]。

纳米粒子（NPs）的理化性质，如粒径、表面电荷和表面修饰，是决定其穿越角膜屏障能力的关键因素[[21], [22], [23]]。研究表明，最佳粒径（通常在20-150 nm范围内）可增强角膜上皮穿透效率[23]。此外，表面电荷影响粒子-细胞相互作用，带正电的粒子通常表现出更高的细胞亲和力[24]。表面修饰的NPs可通过与细胞受体的相互作用进一步提高摄取效率[25]。亲水性和疏水性是影响NPs-细胞膜相互作用的基本性质，亲水性NPs通常依赖受体介导的内吞作用，而疏水性NPs更可能通过非受体介导的内吞作用进入细胞[26]。Stellacci等人的研究表明，具有交替疏水-亲水表面的NPs可通过被动扩散进入细胞[27]。Shen等人最近的研究利用全氟碳链的疏水性质破坏眼表紧密连接，增强了蛋白质药物在眼后段的积聚[28]。目前关于NPs亲水和疏水性质在穿越生物屏障方面的研究主要集中在细胞相互作用上，对其在组织水平穿透的影响关注有限。理解NPs疏水性在穿越组织屏障中的作用，对于开发高效的药物递送系统至关重要。

将疏水性氨基酸引入细胞穿透肽（CPPs）已被证明能有效增强其穿越复杂组织屏障的能力。例如，Jiang等人报道，色氨酸（W）突变的penetratin显著促进了蛋白治疗药物穿越眼表屏障的转位，实现了向眼后段的递送[29]。基于该策略，我们课题组通过将Beva与修饰有疏水性氨基酸酪氨酸（Y）的His6肽共自组装，开发了YHmA@Beva。与未修饰的His6对照（HmA@Beva）相比，该修饰显著提高了角膜穿透效率[30]。综上所述，这些发现表明疏水性氨基酸功能化是优化载体性能的强有力策略，为非侵入性蛋白质递送系统的开发提供了有前景的途径。自然界中存在八种疏水性氨基酸，通常包含两类主要的疏水性侧链：烷基链和芳香环。在本研究中，我们选择了缬氨酸（V）和异亮氨酸（I）代表疏水性烷基侧链，Y和W代表疏水性芳香环侧链。我们提出，通过特定的疏水性氨基酸（V、I、Y和W）功能化His6肽，并与Beva共自组装（VHmA@Beva、IHmA@Beva、YHmA@Beva和WHmA@Beva），可作为优化CorNV治疗的稳健策略（图1a）。在碱烧伤CorNV大鼠模型评估中，我们观察到VHmA@Beva未能显著抑制新生血管生成，而IHmA@Beva、YHmA@Beva和WHmA@Beva制剂表现出明显的抑制效果。值得注意的是，我们发现IHmA@Beva表现出最强大的疗效，实现了接近100%的CorNV抑制（图1b），该结果优于侵入性策略通常报道的约95%的效率[31,32]，后者往往受限于其侵入性。我们将这种卓越性能归因于IHmA@Beva较长的眼部滞留时间和改善的角膜穿透性，使其在所测试的NPs中最快速、最高效地将Beva递送穿越角膜屏障（图1c）。因此，我们建议将疏水性氨基酸残基引入肽组装体对于克服生物屏障至关重要，为优化CorNV等疾病的非侵入性疗法提供了有前景的途径。

章节片段

材料

硝酸锌六水合物（Zn(NO?)?·6H?O，≥99%）、聚维酮（PVPON，Mw约58 k）、氢氧化钠（NaOH，≥99%）、浓盐酸（HCl，37%）、磷酸缓冲液（PBS）、牛血清白蛋白（BSA）、猪胃粘液蛋白、聚乙烯亚胺（PEI，Mw约8 k）、乙二胺四乙酸（EDTA）和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）均购自阿拉丁（中国）。修饰有疏水性氨基酸的His6，包括Y-His6、W-His6等。

XHmA@Beva NPs的合成与表征

在先前的研究中，我们系统地优化了HmA@Beva的合成条件，包括Zn2+与His6肽的比例以及Beva与His6肽的比例[[17], [18], [19]]。考虑到XHmA@Beva NPs的形成遵循与HmA类似的驱动力，即His6肽与Zn2+之间的配位作用，我们未进一步优化XHmA@Beva NPs的合成条件，而是沿用此前报道的优化条件。

如表1所列，DLS测量结果……

讨论

在本研究中，我们聚焦于开发一种有效的非侵入性递送策略，将Beva递送至CorNV治疗领域，CorNV是全球角膜失明的主要原因，尤其在发展中国家。多种递送载体，包括水凝胶、两亲性共聚物胶束、PLGA粒子和脂质体，已被广泛研究用于CorNV治疗中的Beva递送[54]。然而，这些载体在抑制CorNV方面显示出的效果有限，报道的最高抑制率约为……

结论

我们合成了一系列XHmA@Beva NPs，并对其理化性质进行了表征，包括粒径、PDI、Zeta电位、包封率（EE%）和载药量（LC%）。所有XHmA@Beva颗粒具有相似的粒径范围，从101.5±4.6 nm到112.1±5.8 nm，PDI在0.17±0.02到0.19±0.03之间，Zeta电位范围为25.9±1.3 mV到28.1±1.1 mV。通过XHmA@Beva载体，Beva的包封率（EE%）范围为94.4±1.9%到96.2±2.3%，载药量（LC%）范围为47.2±1.0%到48.1%，储存后Beva的生物活性……

声明

伦理批准：所有动物实验均严格按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导原则进行。动物实验方案经温州中国科学院动物实验委员会审查并批准（批准号：Syxk 2021-0040）。

数据及材料可用性：支持本研究结果的原始数据和处理后的定量数据已包含在文章和补充信息中。

作者贡献

概念化、调查、数据整理和方法学：W. Ye、T. Jiang和B. Tang；软件和可视化：Y. Jin和W. Jiang；形式分析：J. Cai；撰写——初稿：W. Ye和X. Zan；撰写——审阅与编辑及资金获取：X. Zan；监督：L. Ye。

利益冲突声明

所有作者已阅读并批准提交最终稿件，声明不存在利益冲突。

数据可用性

原始数据将在合理请求后提供。

CRediT作者贡献声明

叶文莲：撰写——初稿、方法学、数据整理、概念化。姜天方：方法学、调查、数据整理、概念化。唐伯娇：方法学、调查、数据整理。金悦熙：验证、软件。蒋婉娜：验证、软件。蔡进：验证。 zan兴杰：撰写——审阅与编辑、资金获取。叶丽莎：撰写——审阅与编辑、监督。

叶文莲|姜天方|唐伯娇|金悦熙|蒋婉娜|蔡进|zan兴杰|叶丽莎