《Advanced Agrochem》：Neuropeptides regulate insecticide-evasion behaviour by modulating muscle proteins in a fruit borer
编辑推荐：
λ-氯氟氰菊酯（LCT）抗性（LCR）苹果蠹蛾（Cydia pomonella）种群幼虫在LCT胁迫下表现出快速规避行为。LCR幼虫呈现更长的肌节（sarcomere）及肌肉蛋白基因的上调表达。敲降肌肉蛋白基因会损害肌节的完整性和幼虫的运动能力。前胸腺激素基因
λ-氯氟氰菊酯（LCT）抗性（LCR）苹果蠹蛾（Cydia pomonella）种群幼虫在LCT胁迫下表现出快速规避行为。LCR幼虫呈现更长的肌节（sarcomere）及肌肉蛋白基因的上调表达。敲降肌肉蛋白基因会损害肌节的完整性和幼虫的运动能力。前胸腺激素基因（PTTH）和corazonin基因（CRZ）在LCR种群头部过表达。神经肽PTTH通过调控肌肉蛋白基因Tn-T及调节幼虫运动能力来调控杀虫剂规避行为。
论文解读
一、研究背景与意义
农业害虫是对全球粮食安全构成持续且重大威胁的重要因素，其造成的经济损失源于直接的植食性危害以及病原微生物的间接传播，导致农产品品质和产量显著下降。为减轻这些不利影响，合成化学杀虫剂的应用已成为最主要且最广泛实施的害虫管理策略。然而，对单一防治方式的过度依赖对害虫种群施加了显著的选择压力，推动了杀虫剂抗性的演化，成为全球作物生产的重大障碍。
昆虫抗药性的演化主要由三种机制驱动：代谢抗性、靶标抗性和行为抗性。代谢抗性通过解毒酶的上调或质变来增强对杀虫剂的解毒能力；靶标抗性源于编码杀虫剂分子靶标基因内的点突变导致结合亲和力降低；而行为抗性则定义为最大限度减少杀虫剂暴露的适应性行为改变，包括回避、减少取食、改变产卵以及活动模式的时间和空间转移。尽管代谢抗性和靶标抗性机制已被广泛研究，但昆虫行为抗性的研究仍然有限，其遗传和生理基础在很大程度上尚未阐明，这构成了对耐药性演化理解的重要知识空白。因此，阐明行为抗性及其调控机制对于深入理解杀虫剂抗性的潜在机制具有重要意义。
苹果蠹蛾（Cydia pomonella）是一种全球检疫性且极具破坏性的蛀果害虫。雌成虫通常在果实表面或邻近叶片产卵，新孵化的幼虫必须在孵化后短时间内（少于24小时）定位并定殖取食位点。卵孵化与幼虫进入果实之间的这一关键时期代表了基于杀虫剂的防治策略的关键脆弱点，因为内部侵染使幼虫在很大程度上对杀虫剂效力不敏感。因此，阐明该害虫的行为抗性特征对于全面理解抗性机制至关重要。本研究采用λ-氯氟氰菊酯抗性（LCR）苹果蠹蛾种群，研究杀虫剂暴露下幼虫的回避行为，旨在为理解行为抗性提供理论基础。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过比较敏感（SS）与抗性（LCR）种群在λ-氯氟氰菊酯胁迫下的运动行为差异，发现LCR幼虫在观察初期表现出显著更快的爬行速度和更长的爬行距离，但随后运动能力的下降也更为显著，表明长期杀虫剂胁迫可能对运动能力产生影响并遗传至后代。通过比较蛋白质组学筛选出8种在LCR种群中显著上调的肌肉蛋白，包括肌钙蛋白C（Tn-C）、肌球蛋白重链（MHC）、肌肉LIM蛋白（MLP）、肌钙蛋白T（Tn-T）、twitchin（Twi）、myofilin（Mfn）、肌球蛋白调节轻链（MRLC）和原肌球蛋白-1（Tm-1）。RT-qPCR验证显示其中5个基因（Tn-C、Tn-T、Mfn、MRLC、Tm-1）的mRNA水平在LCR种群中显著上调。肌节结构观察显示LCR幼虫胸足肌节长度显著长于SS种群。RNA干扰实验证实敲降Tn-C、Tn-T和Mfn会显著缩短肌节长度并损害幼虫运动能力。转录组分析发现LCR种群头部前胸腺激素基因（PTTH）和corazonin基因（CRZ）表达显著升高，且RNAi沉默PTTH可显著降低Tn-T的mRNA水平并损害幼虫爬行能力。分子对接分析显示PTTH和CRZ均能与λ-氯氟氰菊酯结合。该研究首次报道神经肽通过调控肌肉蛋白表达影响肌肉收缩，进而调节昆虫的杀虫剂规避行为。
三、主要技术方法
本研究使用了以下关键技术方法：建立λ-氯氟氰菊酯抗性（LCR）苹果蠹蛾种群（由敏感种群经连续人工筛选获得，LD50为敏感种群的23.85倍）；利用比较蛋白质组学（数据存储于ProteomeXchange Consortium，编号PXD075379）筛选差异表达肌肉蛋白；采用视频追踪系统结合ImageJ软件定量分析幼虫运动行为参数；运用激光共聚焦显微镜结合荧光染色观察肌节结构；采用RT-qPCR检测基因表达水平；利用RNA干扰技术验证基因功能；采用AlphaFold蛋白结构预测与AutoDock Vina分子对接分析神经肽与杀虫剂的结合模式；转录组测序数据存储于GSA数据库（编号CRA039670）。
四、研究结果
3.1 λ-氯氟氰菊酯胁迫对苹果蠹蛾幼虫运动的影响： 通过视频追踪分析发现，SS种群幼虫在λ-氯氟氰菊酯暴露后呈现双相爬行模式：Ⅰ期（前2.6分钟）平均爬行速度和距离显著高于对照组，Ⅱ期运动能力持续下降且显著低于对照组。LCR种群幼虫在观察初期（Ⅰ期，前3.4分钟）的平均爬行速度和距离显著高于SS种群，但Ⅱ期的下降也更为显著。
3.2 SS与LCR种群爬行肌肉结构差异： 通过共聚焦显微镜观察4龄幼虫胸足肌肉，发现LCR幼虫的平均肌节长度（3.03 ± 0.08 μm）显著长于SS种群（2.67 ± 0.13 μm）。
3.3 肌肉蛋白表达谱： 蛋白质组学鉴定出8种在LCR种群中显著上调的肌肉蛋白，RT-qPCR验证其中5个基因（Tn-C、Tn-T、Mfn、MRLC、Tm-1）的mRNA水平显著上调。组织特异性表达分析显示不同肌肉蛋白在胸、腹、胸足和腹足等组织中呈现差异化表达模式。
3.4 肌肉蛋白表达对肌肉结构的影响： RNAi敲降Tn-C、Tn-T和Mfn后，肌节长度分别显著缩短至2.8 μm、2.7 μm和2.7 μm（对照为3.2 μm），而敲降MRLC和Tm-1对肌原纤维长度无显著影响。
3.5 肌肉蛋白基因敲降损害幼虫运动： 敲降Tn-C后幼虫爬行时间显著增加至3.89分钟，爬行距离增加至71.03 cm；敲降Tn-T后爬行时间增加至3.85分钟，爬行距离增加至76.29 cm；敲降Mfn后爬行时间显著增加至3.85分钟；而敲降MRLC和Tm-1对运动参数无显著影响。
3.6 神经肽基因敲降抑制肌肉蛋白基因mRNA丰度并改变幼虫运动： 转录组和RT-qPCR分析显示PTTH和CRZ在LCR种群头部表达显著升高。RNAi沉默PTTH后Tn-T的mRNA水平显著降低，幼虫爬行时间显著增加而爬行速度和距离显著降低；沉默CRZ后爬行时间和距离显著增加但平均速度无显著变化。
3.7 神经肽与λ-氯氟氰菊酯的结合： 分子对接分析显示PTTH和CRZ与λ-氯氟氰菊酯形成的复合物Vina评分分别为–6.1 kcal/mol和–7.5 kcal/mol，其中PTTH通过ARG-72与λ-氯氟氰菊酯形成氢键（键长3.3 ?），而CRZ通过其他非共价相互作用结合。
五、讨论与结论
本研究首次报道神经肽通过调控肌肉蛋白表达影响肌肉收缩，进而调节昆虫的杀虫剂规避行为。LCR种群已发展出独特的行为策略，利用短时爆发性运动来逃避杀虫剂胁迫，从而促进抗性发展。较长的肌节为LCR幼虫提供了增强的逃逸运动生理基础，构成其行为抗性的基础。Tn-C、Tn-T和Mfn在维持正常肌节尺寸和运动行为中发挥关键作用。PTTH信号可能通过调控肌肉结构蛋白的表达影响幼虫运动，而CRZ更可能通过神经系统调节介导应激反应。分子对接结果提示两种神经肽对λ-氯氟氰菊酯具有结合亲和力，为杀虫剂胁迫激活神经肽介导的昆虫运动提供了理论基础。然而，当前调控机制仍需更直接的验证，例如利用CRISPR-Cas9基因编辑工具实现关键神经肽基因的功能获得或缺失，以及阐明神经肽调控肌肉蛋白的具体信号通路。此外，本研究对害虫行为的观察局限于简化环境，实际田间条件下杀虫剂在果实表面的残留分布更为复杂，未来需模拟田间自然残留分布或开展直接田间试验，以进一步阐明害虫在自然栖息地农药胁迫下的适应性行为策略，为农业生态系统中害虫行为抗性的精准防控奠定理论基础。
