编辑推荐：
DNA复制稀释亲代组蛋白及其翻译后修饰（PTMs），需要在新整合组蛋白上恢复表观遗传标记。H3K9me3（组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化）恢复异常缓慢，可持续至随后的G1期，但调控这一延迟的机制仍不清楚。在此，研究人员证明，RIF1（Rap1相互作用因子1）在
DNA复制稀释亲代组蛋白及其翻译后修饰（PTMs），需要在新整合组蛋白上恢复表观遗传标记。H3K9me3（组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化）恢复异常缓慢，可持续至随后的G1期，但调控这一延迟的机制仍不清楚。在此，研究人员证明，RIF1（Rap1相互作用因子1）在有丝分裂退出期间与异染色质重新结合，为组蛋白甲基转移酶恢复H3K9me3沉积建立允许性染色质环境。RIF1促进SUV39H1（SET结构域包含的组蛋白赖氨酸甲基转移酶）和HP1α/β（异染色质蛋白1α/β）的募集以及G1期H3K9三甲基化增加。RIF1还将蛋白磷酸酶1α（PP1α）募集至异染色质，且RIF1-PP1α相互作用对维持H3K9me3水平至关重要。此外，RIF1-PP1复合物在时间上限制Aurora激酶（极光激酶）在异染色质处的活性，防止复制前过早发生H3S10磷酸化（H3S10ph），并为SUV39H介导的H3K9me3重建创造允许性时间窗。
研究背景与科学问题：DNA复制会稀释亲代组蛋白及其翻译后修饰（PTMs），新整合组蛋白需恢复表观遗传标记。多数标记在复制叉后较快恢复，但H3K9me3（组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化）、H3K27me3和DNA甲基化恢复较慢，其中H3K9me3恢复可延续至下一G1期甚至早期S期。异染色质在S期中晚期复制，复制时序程序被认为可能为赖氨酸甲基转移酶（KMTs）完成H3K9me3恢复提供时间；RIF1（Rap1相互作用因子1）是复制时序主调控因子，G1期缺失RIF1可导致下一S期H3K9me3丢失。然而，决定H3K9me3缓慢重建时序的分子机制，以及RIF1是否通过复制时序之外机制促进H3K9me3恢复，仍不清楚。研究人员据此开展研究，提出RIF1在有丝分裂退出和G1期重建允许性异染色质环境，并通过RIF1-PP1α限制Aurora激酶活性。该研究结论是RIF1在整个细胞周期维持H3K9me3水平，不只依赖复制时序控制；其意义在于揭示H3K9me3复制后缓慢恢复的分步时序机制。
关键技术方法（≤250字）：样本来源于小鼠胚胎干细胞（ESCs）细胞系，包括Rif1-WT、Rif1-KO、Rif1-HEMI、Rif1-ΔPP1、Rif1-miniAID-mCherry、Suv39h1/2双敲除及O6-Tether等，未涉及人类队列。关键技术包括RIF1 ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）、H3K9me3 ChIP-seq、Hi-C（染色体构象捕获）、Repli-seq（复制时序测序）、lamin B1免疫荧光联合3D-DNA-FISH（三维荧光原位杂交）、iPOND-SILAC-MS（分离新生DNA上的蛋白质结合细胞培养中氨基酸稳定同位素标记质谱）、iPOND-MS、FACS（荧光激活细胞分选）、EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）脉冲-追踪、雷帕霉素诱导的核纤层tethering、ChIP-qPCR和ELISA。
研究结果：（1）RIF1调控异染色质锚定至核外周（RIF1 regulates heterochromatin anchoring to the nuclear periphery）。研究人员依据RIF1 ChIP-seq与lamin B1 DamID，将RIF1关联结构域（RADs）按拓扑关联结构域（TADs）分为6簇；cluster 1（高RIF1-高lamin B1）维持晚复制，cluster 2（高RIF1-中等lamin B1）在Rif1缺失后转为早复制。Hi-C亚区室分析显示cluster 1主要位于B3并保持，cluster 2在Rif1-KO后近半由B3转B1；3D-FISH显示cluster 2在Rif1-KO ESCs中内部化，而cluster 1保持外周。结论是依赖RIF1维持复制时序和B区室关联的区域，也以RIF1依赖方式保留在核外周。（2）RIF1缺失时H3K9me3下降并非染色质结构或复制时序改变的主要驱动因素（Upon RIF1 loss, the decrease of H3K9me3 is not the main driver of chromatin architecture or replication timing changes）。Suv39h1/2双敲除ESCs中cluster 2的H3K9me3降低，并出现A区室偏移和内部化；Rif1-KO中cluster 1和2的H3K9me3均降低，但仅cluster 2发生B3-to-B1和内部化。ERVKs等重复序列H3K9me3降低与RIF1峰对应。将O6区重新tethering至核纤层并恢复H3K9me3，不能恢复晚复制。结论是RIF1对H3K9me3的调控独立于其对染色质结构和复制时序的控制，至少cluster 1如此；恢复外周定位和H3K9me3不足以恢复晚复制。（3）RIF1促进G1期H3K9me3水平恢复（RIF1 promotes the restoration of H3K9me3 levels in G1 phase）。研究人员用Rif1-miniAID-mCherry在分裂期急性降解RIF1后释放至G1；iPOND-SILAC-MS显示亲代和新整合H3上H3K9me3轻度降低，H3K9me2倾向积累，K14ac肽段无同样趋势，H3K27me3和H3K36me3不受影响；iPOND-MS显示G1异染色质蛋白再结合延迟，包括SUV39H1、HP1α、HP1β、PP1α，MCM复合物再装载略降低。结论是RIF1在有丝分裂退出期间需要重新启动G1期H3K9me3恢复。（4）RIF1-PP1对H3K9me3恢复是必需的（RIF1-PP1 is required for H3K9me3 restoration）。Rif1-ΔPP1点突变破坏PP1α结合后，ERVKs和cluster 1的H3K9me3降低，cluster 1不内部化、不区室偏移；cluster 2中RIF1半剂量已足以影响H3K9me3、内部化和B1偏移。结论是RIF1-PP1α相互作用对H3K9me3维持重要，并促进SUV39H1、HP1α/β、PP1α在G1的异染色质再结合。（5）RIF1-PP1α限定Aurora激酶在异染色质上的活性时间（RIF1-PP1α time the activity of Aurora kinases on heterochromatin）。Rif1-KO和Rif1-ΔPP1中H3S10ph foci比例增加；FACS分选G1和早期S期显示G1已略高、S期进一步增加，早于正常Aurora B起始；hesperadin抑制Aurora激酶可逆转；RIF1缺失不影响Aurora B水平及周期动态。EdU脉冲-追踪显示Rif1-KO和Rif1-ΔPP1中复制叉与H3S10ph在着丝粒周围重叠，甚至未复制的MCM3相关EdU阴性染色中心已有H3S10ph。结论是RIF1-PP1α使Aurora激酶活性限定于复制叉通过之后，防止复制前H3S10ph，为SUV39H介导的H3K9me3恢复提供时间窗。
讨论与结论：讨论指出，H3K9me3、H3K27me3和DNA甲基化复制后恢复异常缓慢的机制长期不明；Klein and colleagues曾显示晚G1期消除RIF1会在同一细胞周期H3K9me3下降前改变复制时序，提示异染色质复制起点提前触发可能导致H3K9me3恢复缺陷。本研究揭示RIF1超越复制时序调控的复杂作用：有丝分裂退出时RIF1结合异染色质，促进HP1α/β和SUV39H1再结合，重建G1允许性染色质；RIF1将PP1α募集至中晚复制染色质；RIF1-PP1α还限制Aurora激酶活性于复制叉后，防止H3S10ph过早出现。讨论还指出，RIF1缺失导致末期和G1期H3S10ph去除延迟或过早出现；其他PP1调节互作蛋白（RIPPOs）如Repo-Man/PP1、Ki-67可能在不同域执行类似功能；原文提示核纤层可能是高PP1活性域。研究还表明，Rif1缺失所致H3K9me3降低不足以单独解释cluster 1的区室偏移或内部化，cluster 1锚定与H3K9me3维持分开控制；cluster 2中RIF1可能直接锚定染色质，或外周定位依赖H3K9me3水平。研究结论（译）：总之，研究人员证明RIF1在整个细胞周期维持H3K9me3水平，不仅依靠其控制复制时序的作用；RIF1在有丝分裂退出期间重塑染色质景观，并在复制叉通过前拮抗异染色质处的Aurora激酶。研究数据提示，H3K9me3独特重建动态背后的“时钟”分子机制是一个多步骤过程，涉及PP1逆转并对抗激酶活性，以重建异染色质并维持其身份。
