RPA辅助的三通道Cas13a-Cas13b-Cas12a荧光检测体系用于病毒核酸检测

《Analytica Chimica Acta》：RPA-assisted three-channel Cas13a-Cas13b-Cas12a fluorescence architecture for three-channel viral nucleic acid detection

　　

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  正交的Cas13a、Cas13b和Cas12a实现三通道CRISPR读出。
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  VEEV、TBEV和EEEV/WEEV分别分配至FAM、ROX和HEX通道。
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  整合检测方法可在混合物中以100拷贝/μL检测每个目标。
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  在人工配制马鼻腔拭子基质中解析了七种目标模式。

引言

马匹通过贸易、运输和赛马活动日益频繁的跨区域移动，加强了对快速检测临床上重要的马相关病毒的需求。委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、东部马脑炎病毒（EEEV）、西部马脑炎病毒（WEEV）和蜱传脑炎病毒（TBEV）可在易感马匹中引起发热、神经功能障碍和脑炎；VEEV、EEEV和WEEV是蚊媒甲型病毒，而TBEV是蜱媒黄病毒。尽管EEEV和WEEV在遗传学和抗原学上不同，但重叠的临床症状支持将这两种病毒纳入同一鉴别诊断面板中[1]，[2]，[3]。因此，一种既能区分VEEV和TBEV又能对EEEV/WEEV进行群检测的多靶标方法，可支持港口检疫、农场级别筛查和暴发调查。

病毒分离、血清学检测以及RT-PCR或RT-qPCR仍是鉴定这些病原体的核心方法，但所有这些方法都难以转化为快速鉴别筛查。病毒分离保留确认价值，但需要活性标本、长期培养和生物安全条件。血清学方法可评估暴露或免疫状态；然而，早期感染、交叉反应抗体、配对血清解读和疫苗接种史可能会使病原体水平归因复杂化。RT-qPCR提供敏感且定量的结果，而热循环仪器、标准化实验室和经过培训的人员可能限制在海关口岸、基层兽医实验室和现场采样点的检测[1]，[4]。

重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种通常在37-42°C运行的等温核酸扩增方法，可在几十分钟内产生扩增产物，从而降低热循环相关的仪器障碍[5]，[6]。基于CRISPR的诊断随后通过靶标激活的附带切割将序列特异性靶标识别转化为可测量信号[7]，[8]，[9]。由于Cas13效应子识别RNA靶标并切割RNA报告基因，而Cas12a识别DNA靶标并切割单链DNA报告基因[9]，[10]，[11]，这些报告基因偏好可用于在简化的等温工作流程中构建正交荧光通道。

多重CRISPR检测已成为分子诊断的重要方向，因为正交的效应子-报告基因组合允许在协调的读出系统中解读多种核酸靶标。SHERLOCK及后续平台展示了灵敏的核酸检测和多重荧光读出[11]，[12]。CARMEN-Cas13通过微孔阵列区室化将CRISPR诊断扩展至高通量病原体面板^[13]，而Cas12a/Cas13a组合已实现在单一反应中的双靶标检测^[14]。然而，针对马相关嗜神经病毒的应用仍然有限，紧凑的三通道面板可减少组合筛查所需的下游CRISPR反应。

为应对这一需求，为VEEV、TBEV和EEEV/WEEV靶标建立了单重RPA-CRISPR/Cas检测，随后将LwaCas13a、PsmCas13b和LbaCas12a结合在单一三通道荧光读出中。方法学贡献是将正交三效应子读出应用于马病毒面板，通过此方式将三个下游CRISPR反应整合为一个。由于上游扩增和转录保持分离，该系统作为下游读出组合呈现，而非一锅法多重RPA检测。

章节摘要

材料与试剂

用于初步基质评估的马鼻腔拭子样本由上海海关储存并提供，MagaBio Plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒购自BioFlux。RPA引物、crRNA转录模板和荧光报告基因由上海 Sangon Biotech 合成，而ssRNA-RQ报告基因由GenScript合成。LbaCas12a购自诺普（苏州），LwaCas13a根据 进行表达和纯化

三种单重RPA-CRISPR/Cas检测的分析性能

使用标准质粒评估VEEV、TBEV和EEEV/WEEV靶标片段的上游RPA扩增，琼脂糖凝胶电泳显示相应反应产生预期大小的条带（图1A1-A3）。凝胶检测限名义值为VEEV和TBEV的100拷贝/μL（相当于每个反应200个初始拷贝）和EEEV/WEEV检测的1000拷贝/μL（相当于每个反应2000个初始拷贝），随后这些产物用于

讨论

马相关嗜神经病毒代表重要的一体化健康监测目标，因其对动物健康与公共健康的意义。美洲WEEV重新出现、美国东北部EEEV活动以及欧洲马匹TBEV相关神经疾病的近期报道，凸显了对这些病原体进行快速鉴别检测的需求[2]，[3]，[17]，[18]，[19]，[20]。尽管传统方法包括病毒分离、血清学检测，

结论

本研究将针对VEEV、TBEV和EEEV/WEEV的单重RPA-CRISPR/Cas检测整合为正交Cas13a-Cas13b-Cas12a荧光读出，通过此方式解析了三个目标分配通道，并在等浓度三靶标混合物中以100拷贝/μL检测。初步人工配制鼻腔拭子实验展示了基质兼容性和在测试条件下与RT-qPCR的一致性。由于扩增、T7转录和纯化保持

生物安全声明

本研究未培养或处理任何活体或可复制的VEEV、TBEV、EEEV、WEEV、WNV、HeV或EIAV。重组质粒仅包含选定的病毒靶标片段，且不能产生有感染性病毒。检测开发和基质评估使用重组质粒标准和存档核酸材料进行。扩增前和扩增后操作物理分离，并采取适当的个人防护设备，

CRediT作者贡献声明

孙晓东： 写作 – 审阅与编辑、方法学。薛军信： 写作 – 审阅与编辑、验证、监督、资金获取、概念化。王燕： 资源、方法学。李建： 资源、方法学、资金获取。牛兵： 写作 – 审阅与编辑、监督、资源、方法学。陈柯宇： 写作 – 初稿、可视化、验证、方法学、调查、形式化分析。于磊： 调查、数据管理。陈勤： 写作 – 审阅与

未引用参考文献

[36]。

伦理声明

本研究未涉及前瞻性动物实验或从活体动物额外收集样本。马鼻腔拭子标本是常规检疫监测期间最初收集的存档残留样本，使用前已匿名化处理。仅纳入先前被RT-qPCR分类为阴性的标本，一部分标本掺入非感染性质粒标准品用于分析基质评估。未针对本

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可根据请求提供。

资金

本研究由上海市农业科技重点技术研发计划（25N42800100）和上海市农业科技创新项目（2025-02-08-00-12-F00059）资助

利益冲突声明

? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢上海海关动植物与食品检验检疫技术中心提供马鼻腔拭子样本和实验室支持。

Keyu Chen|Tiantian Gao|Lei Yu|Qiang Zhang|Yingzheng Lin|Yiting Wang|Wei Xiong|Yan Wang|Jian Li|Xiaodong Sun|Junxin Xue|Qin Chen|Bing Niu