跨平台评估用于DNA定量检测的数字PCR系统：对方法标准化和计量可比性的启示

《Analytica Chimica Acta》：A multi-platform evaluation of digital PCR systems for DNA quantification: Implications for method standardization and metrological comparability

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  对14种数字PCR平台（8种液滴式，6种芯片式）进行了全面评估
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  绝对定量显示出较大的平台间差异（RSD 6–13%）
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  分配体积的不准确性导致显著偏差
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  双链比率测量结果稳健且与平台无关（RSD ≤ 2.15%）
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  体积校准对于绝对定量至关重要，但对于相对定量则不是必需的

引言

聚合酶链反应（PCR）是最广泛使用的基于DNA的核酸（NA）检测方法。PCR技术的发展已经从传统的终点PCR发展到实时定量PCR（qPCR），再到数字PCR（dPCR）。qPCR和dPCR都能实现精确的NA定量；然而，qPCR通过校准曲线提供相对定量，而dPCR则无需外部校准剂即可实现绝对定量[1], [2]。这是通过将样本随机分成数万个微小的反应腔室来实现的，这些反应腔室遵循泊松分布[3], [4], [5], [6]，然后确定阳性腔室的比例，并使用泊松统计量计算绝对目标浓度（λ = -ln(1-N_pos/N_tot），其中N_pos/N_tot是阳性腔室的比例。这种分配策略不仅消除了对校准曲线的需求，还比qPCR具有更高的抗干扰能力和精度[7], [8]。因此，dPCR在疾病诊断、病原体检测、基因表达分析、环境监测、罕见突变检测、转基因生物（GMO）检测以及参考材料认证等多个领域取得了显著进展[7], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]。

dPCR基于计数的特性使其能够通过单位计数实现可追溯的定量[18], [19], [20]。这种可追溯性已经通过国际合作得到了验证，结果显示dPCR与流式细胞计数结果非常接近[21]。因此，dPCR被公认为是用于临床诊断和GMO检测中的DNA参考材料（RMs）的主要参考测量方法[22], [23], [24], [25]，并且在ISO 17511指南中也被视为高级参考测量方法[26]。

商用dPCR平台可以分为基于腔室的系统（例如Fluidigm BioMark、Thermo Fisher QuantStudio、Qiagen QIAcuity）和基于液滴的系统（例如Bio-Rad QX系列、Stilla Naica），每种系统都有不同的分配机制、分配体积、动态范围和自动化程度[27]。Bio-Rad QX系列仍然是最受欢迎的ddPCR系统之一。其他平台，包括QuantStudio系列（Thermo Fisher）、Clarity（JN MedSys）、Qiacuity ONE（Qiagen）和Naica（Stilla Technologies），也越来越被用于NA定量。dPCR的发展趋势是从多仪器设置向一体化系统发展。基于液滴的系统生成水包油乳液，具有较高的腔室数量，而基于芯片的系统则提供固定的腔室几何结构和简化的操作流程；一体化系统集成了生成、放大和读取功能，提高了便利性。在中国，已经开发了几种一体化dPCR系统，如Sniper DQ32、TargetingOne D50、Forevergen Microdrop ONE和Maccura D600。

鉴于商用dPCR平台的多样性不断增加，了解它们的分析性能和跨平台可比性对于常规定量以及高级参考测量程序至关重要。最近的一些研究已经解决了平台特定问题，如标准化验证方案和系统评估液滴体积效应[28], [29]。然而，仍缺乏使用相同经过充分表征的RMs和优化过的双链检测方法对基于液滴和基于芯片的系统进行全面比较的研究。这种比较不仅有助于识别影响准确性的关键因素，还可以为跨平台的方法转移和协调提供实际指导。为了填补这一空白，我们选择了14种dPCR系统进行测试，这些系统在中国有市场销售，代表了主要的技术实现方式（基于液滴vs基于芯片），并且在当前市场上扮演了多样化的角色，包括广泛应用的黄金标准仪器和新一代一体化平台。

在这项研究中，我们使用经过认证的RMs和标准化的双链检测方法系统评估了14种dPCR平台，以确定分配体积、稀释和分配分类对整体测量不确定性的影响，并判断基于比率的定量是否为GMO含量分析等应用提供了一种稳健且与平台无关的策略。我们的最终目标是提供基于证据的定量核酸分析方法标准化和平台选择的建议。

章节片段

材料

由BeiDaNong Biotechnology Co., Ltd.提供了纯合转基因（GM）玉米DBN9858及其非GM对应物的种子。经过纯合性检测后，收集了单个植物的叶子以制备基因组DNA（gDNA）参考 material（RM）。对于质粒DNA（pDNA）RM，我们使用了之前构建的pBI121-Screening质粒，其中包含11个常用的外源元件（P-35S、P-FMV35S、P-NOS、Bar、NPTII、HPT、Pmi、T-NOS、T-35S、T-g7和T-e9）以及六个主要作物基因

dPCR检测方法的优化

引物-探针组合的选择是影响测量不确定性的一个重要因素。DBN9858/zSSIIb和P-NOS/zSSIIb双链dPCR检测方法在QX200液滴dPCR平台上进行了优化。使用理论上的GMO含量为100%的纯合DBN9858 gDNA作为模板，优化了DBN9936/zSSIIb双链dPCR检测方法的引物/探针浓度和退火/延伸温度。而含有每个分子一个P-NOS和zSSIIb拷贝的pBI121-Screening质粒被用作模板

结论

对14种dPCR平台的全面评估表明，优化过的双链检测方法可以在不同系统之间可靠地转移，用于相对定量，其中拷贝数比率的跨平台一致性非常好（基因组DNA的RSD ≤ 2.15%，质粒DNA的RSD ≤ 0.47%）。对于这种基于比率的应用，分配体积校正因子（例如QIAcuity系统中的VPF）是不必要的，因为在双链格式下体积效应会相互抵消。

相反，对于绝对拷贝...

CRediT作者贡献声明

高洪飞：可视化、调查。李云静：验证、调查。朱莉：数据管理。吴钢：撰写 – 审校与编辑、监督、软件、项目管理。吴玉华：撰写 – 审校与编辑、初稿撰写、资金获取、正式分析、概念构思。李俊：调查、正式分析、数据管理。万丹锋：验证、数据管理

利益冲突声明

所有作者声明他们没有可能影响本文工作的利益冲突或个人关系。

数据可用性

数据将应要求提供给相应的作者，用于非商业研究目的。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益冲突或个人关系。

致谢

本工作得到了生物育种-国家科技重大专项（项目编号 2022ZD04020）的支持。

李俊|万丹锋|高洪飞|李云静|朱莉|吴钢|吴玉华