《Veterinary Sciences》：Integrated Phenotypic and Molecular Profiling of Antimicrobial Resistance, Virulence, and Mouse Lethality in Escherichia coli from Diarrheic Calves
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腹泻犊牛可携带具有多样化抗菌药物耐药性和毒力特征的大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli），这使疾病治疗与控制复杂化。本研究对源自中国河北省两个大型牛场腹泻犊牛的大肠杆菌分离株，就其抗菌药物耐药性、耐药基因与毒力基因、系统发育群（phylo
腹泻犊牛可携带具有多样化抗菌药物耐药性和毒力特征的大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli），这使疾病治疗与控制复杂化。本研究对源自中国河北省两个大型牛场腹泻犊牛的大肠杆菌分离株，就其抗菌药物耐药性、耐药基因与毒力基因、系统发育群（phylogenetic groups）以及实验性小鼠致死性进行了表征。研究人员对102份腹泻犊牛粪便样本进行了检测。采用Kirby–Bauer纸片扩散法（Kirby–Bauer disk diffusion method）测定抗菌药物敏感性，通过聚合酶链式反应（PCR）检测耐药基因和毒力基因并确定系统发育群，并在小鼠攻毒模型中评估致死性。共获得45株大肠杆菌分离株（44.1%），主要归属于系统发育群B1（64.4%），其次为A群（22.2%）和B2群（13.3%）。耐药率最高的是头孢曲松（ceftriaxone，26.7%），其次是头孢他啶（ceftazidime，24.4%）、氨苄西林（ampicillin，22.2%）和四环素（tetracycline，13.3%），15.6%的分离株为多重耐药（multidrug resistant，MDR）。基于通用PCR检测，所有分离株均检出blaTEM基因，而sul1、tetA、blaCTX-M-1、tetB、blaCTX-M-55和qnrS的检出率为2.2%–17.8%。基于毒素相关标志物的PCR检测，分离株被划分为分子型产肠毒素大肠杆菌（molecular ETEC，n = 9）、分子型产志贺毒素大肠杆菌（molecular STEC，n = 10）、分子型ETEC/STEC杂交株（n = 6）或其他（n = 20）。20株（44.4%）在小鼠中表现出高致死性。这些研究结果揭示了犊牛源大肠杆菌在抗菌药物耐药性、毒力及实验性致死性方面存在显著的异质性。
论文解读文章
一、研究背景与目的
抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）已成为兽医和公共卫生领域面临的重大挑战。人类医学和动物生产中抗菌药物的广泛使用所产生的选择性压力，促进了耐药菌群的出现和持续存在。耐药细菌及其相关耐药决定因子可在动物、人类和环境之间传播，降低抗菌治疗的有效性。大肠杆菌作为人类和动物肠道中的常见共生菌，能够获得并传播与耐药性和毒力相关的遗传决定因子，在这一背景下尤为值得关注。
在犊牛中，致病性大肠杆菌，尤其是产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic E. coli，ETEC），是新生及早期犊牛腹泻的重要细菌性病原。犊牛腹泻的发生和严重程度受多种因素影响，包括年龄、免疫状态、环境条件、牧场管理及感染菌株的特性。感染耐药性大肠杆菌不仅影响犊牛健康、福利和生产性能，还可能使治疗管理复杂化。粪便排菌也为致病性和耐药性细菌在牛群及牧场环境中的持续存在和传播提供了途径。
致泻性大肠杆菌包含多种致病变种（pathotypes），其毒力机制和相关遗传决定因子各不相同。ETEC可通过菌毛黏附素（如F5、F17、F41）定植于肠道黏膜，并产生热稳定和/或热不稳定肠毒素。产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing E. coli，STEC）以携带stx1和/或stx2志贺毒素基因为特征，牛被公认为STEC的重要储存宿主。既往研究已记录犊牛源大肠杆菌中存在显著的耐药性和多重耐药现象。然而，耐药基因的检出并不总是与表型耐药相对应，毒力基因的存在也不一定反映菌株的实际毒力水平。
本研究旨在对河北省两个大型牛场腹泻犊牛中分离的大肠杆菌，从系统发育群、抗菌药物敏感性、耐药基因、毒力相关基因、基于PCR的分子致病变种及小鼠致死性等方面进行综合表征，以整合表型耐药与分子耐药及毒力谱和小鼠攻毒结果，探讨抗菌药物耐药性、毒力特征与小鼠致死性之间的关系，为犊牛腹泻相关大肠杆菌的监测和牛生产中抗菌药物的合理使用提供参考信息。
二、主要关键技术方法
研究人员于2025年3月至5月期间，从河北省两个集约化牛场（A场59份、B场43份）共采集102份腹泻犊牛粪便样本，犊牛日龄为10–20天，采样前未接受过抗菌药物、药物、疫苗或抗寄生虫/抗原虫治疗。采用LB肉汤增菌、麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂划线分离纯化大肠杆菌，通过16S rRNA基因PCR扩增及Sanger测序进行分子确认。系统发育群分型采用Clermont三重PCR方法，基于chuA、yjaA基因和TspE4.C2 DNA片段进行分群。抗菌药物敏感性采用Kirby–Bauer纸片扩散法，依据CLSI M100（第30版，2020）标准判定，共测试17种抗菌药物。耐药基因和毒力基因通过PCR检测。分子致病变种依据毒素相关基因（STa、LT、Stx1、Stx2）的PCR检出结果进行划分。小鼠致死性实验采用138只雄性BALB/c小鼠，每株菌3只小鼠腹腔注射约2×108 CFU，观察3天记录死亡情况。
三、研究结果
3.1 大肠杆菌的分离与鉴定
从102份腹泻犊牛粪便样本中分离获得45株大肠杆菌，分离率为44.1%（45/102），其中A场分离率50.8%（30/59），B场为34.9%（15/43）。所有分离株经16S rRNA基因PCR扩增获得约1500 bp的预期产物，BLAST序列分析确认均为大肠杆菌。
3.2 大肠杆菌分离株的系统发育分布
基于经典Clermont三重PCR方案，系统发育群B1为优势群，占29/45株（64.4%），A群包括10株（22.2%），B2群6株（13.3%），未检出D群。
3.3 抗菌药物敏感性与多重耐药谱
在纳入分类分析的12种抗菌药物中，耐药率最高的是头孢曲松（26.7%），其次为头孢他啶（24.4%）、氨苄西林（22.2%）和四环素（13.3%）。庆大霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（TMP/SMX）耐药率各为6.7%，阿米卡星、妥布霉素和诺氟沙星各为4.4%，卡那霉素、环丙沙星和氧氟沙星各为2.2%。45株中有7株（15.6%）被归类为多重耐药，其中6株对3个抗菌药物类别不敏感，1株对全部6个类别均不敏感。
3.4 抗菌药物耐药基因的分布与谱型
共检出7种耐药基因，包括3种β-内酰胺酶基因（blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-55）、2种四环素耐药基因（tetA、tetB）、1种磺胺耐药基因（sul1）和1种质粒介导喹诺酮耐药基因（qnrS）。blaTEM检出率最高，见于全部45株（100.0%），其次为sul1（17.8%）、blaCTX-M-1和tetA（各13.3%）、tetB（11.1%）、blaCTX-M-55（8.9%）和qnrS（2.2%）。共鉴定出9种耐药基因组合谱型，最常见的是单独blaTEM（62.2%），其次为blaTEM+sul1+tetA（13.3%）和blaTEM+tetB（6.7%）。
3.5 耐药基因型与表型耐药之间的关联探索性分析
菌株水平匹配分析显示，blaCTX-M-1与氨苄西林耐药（φ=0.42，q=0.0395）和头孢曲松耐药（φ=0.50，q=0.0133）显著相关；blaCTX-M-55与氨苄西林耐药（φ=0.58，q=0.0133）和头孢曲松耐药（φ=0.52，q=0.0133）显著相关；tetA与四环素耐药（φ=0.42，q=0.0477）、tetB与四环素耐药（φ=0.49，q=0.0378）呈正相关。sul1与TMP/SMX耐药呈正相关但不显著（φ=0.34，q=0.1154）。由于blaTEM在全部45株中均有检出，无法进行统计学关联估计。唯一qnrS阳性菌株对诺氟沙星敏感，但对环丙沙星和氧氟沙星呈中介敏感。
3.6 毒力基因分布与分子致病变种划分
17种毒力相关基因在45株中呈异质性分布。黏附与生物膜相关基因crl和fimH在全部菌株中检出（100.0%）；铁获取相关基因irp2和FyuA检出率分别为86.7%和82.2%；毒素相关基因中astA检出率最高（91.1%），HlyA为17.8%，HlyE未检出。STa和Stx1各检出15株（33.3%），Stx2仅1株（2.2%），F17检出5株（11.1%），LT、F5、F41和eaeA均未检出。基于毒素基因谱，6株（13.3%）为分子ETEC/STEC杂交株，9株（20.0%）为分子ETEC，10株（22.2%）为分子STEC，其余20株（44.4%）归为其他。25株（55.6%）携带至少一种ETEC和/或STEC相关毒素标志物。
3.7 小鼠攻毒后的致死性
小鼠攻毒实验显示菌株间存在显著差异。6株（13.3%）导致3只小鼠全部死亡，14株（31.1%）导致2只死亡，10株（22.2%）导致1只死亡，15株（33.3%）未导致死亡。30株（66.7%）至少导致1只小鼠死亡。依据死亡率分类标准，20株（44.4%）被归入高致死性组，25株（55.6%）归入低致死性组。死亡小鼠剖检可见脾脏暗红至黑色变色和出血、肝脏暗红色变色、小肠肿胀出血等明显病变，组织触印涂片革兰染色可见大量革兰阴性杆菌，从病变组织再分离并经PCR确认均为大肠杆菌。
3.8 毒力特征与小鼠致死性的关联
高致死性菌株在三个系统发育群中均有分布：A群6/10（60.0%）、B1群10/29（34.5%）、B2群4/6（66.7%）。按致病变种分析，分子ETEC中6/9（66.7%）、ETEC/STEC杂交株中3/6（50.0%）、分子STEC中5/10（50.0%）为高致死性，其他组为6/20（30.0%）。STa阳性菌株中60.0%为高致死性，STa阴性菌株中为36.7%；F17阳性菌株中60.0%为高致死性，阴性菌株中为42.5%。相同致病变种、系统发育群或毒力标志物的菌株并未表现出一致的死亡率表型，表明菌株水平存在显著异质性。
四、讨论总结与结论
本研究表明，犊牛源大肠杆菌在表型和分子水平上均存在显著异质性。系统发育群B1占优势，抗菌药物耐药主要集中在特定β-内酰胺类药物，15.6%的菌株为多重耐药。耐药基因携带与表型耐药仅呈部分一致性，表明仅靠分子检测无法可靠预测抗菌药物敏感性。blaTEM在全部菌株中检出但仅10株对氨苄西林耐药，提示通用PCR产物不能确定特定TEM等位基因或其功能表达。毒力谱分析鉴定出分子ETEC、STEC和ETEC/STEC杂交株，并发现多种黏附、持久性和铁获取相关基因的高检出率。然而，致病变种、系统发育背景和单个毒力标志物均不能一致地预测小鼠攻毒模型中的致死性。与既往研究相比，本研究中四环素耐药率明显低于巴西和意大利的报道，多重耐药率低于Sobhy等的报道，而铁获取基因检出率高于瑞典的报道，反映了不同菌株群体间的异质性。研究存在以下局限性：缺乏健康犊牛对照组、未系统筛查其他肠道病原、仅涉及两个牛场、分子致病变种划分未经序列确认或功能毒素检测、每株仅3只小鼠的实验规模限制了对致死性的精确估计。研究结论认为，整合表型敏感性检测、分子表征和流行病学调查的持续监测，可能有助于抗菌药物管理和犊牛健康管理。
