来自Cryptostegia grandiflora乳胶的蛋白酶作为干酪制造替代凝乳剂的研究

《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Latex proteases from Cryptostegia grandiflora as an alternative coagulant for cheesemaking

　　

研究人员使用来自野生藤本植物Cryptostegia grandiflora乳胶的凝乳酶（Cg-coagulant）生产干酪。Cg-coagulant不具有细胞毒性，也未诱导强烈的皮肤反应。Cg-干酪（Cg-cheese）表现出类似乳清干酪（ricotta）的较软结构，而非预期的干酪凝块（cheese curd）结构。对Cg-干酪（贮藏5天）的感官评价显示较高的消费者接受度，可接受指数（acceptability index, AI）超过75%。

**论文解读：来自Cryptostegia grandiflora乳胶的蛋白酶作为干酪制造替代凝乳剂的研究**

干酪（cheese）作为一种全球广泛消费的乳制品，其传统制造依赖于凝乳步骤。酶法凝乳通过蛋白水解酶（proteolytic enzymes）可控水解牛乳酪蛋白，形成具有理想结构和感官特性的凝块，因而优于直接酸化法。目前工业上最普遍使用的凝乳酶是犊牛凝乳酶（calf chymosin），其特异性地切割κ-酪蛋白的Phe₁₀₅–Met₁₀₆键，使酪蛋白胶束失稳并聚合。然而，动物来源凝乳酶供应受限，且重组凝乳酶因涉及基因改造而受到部分消费者排斥。因此，寻找来自植物的野生型凝乳酶成为研究热点。已有多种植物蛋白酶，如无花果蛋白酶（ficin）、木瓜蛋白酶（papain）等被尝试用于干酪制造，但植物蛋白酶普遍底物特异性较宽，易导致过度水解和苦味产生。在此背景下，野生藤本植物Cryptostegia grandiflora的乳胶被证实富含半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases），其初步凝乳潜力已有报道，但系统评估其用于干酪制造的研究尚缺乏。本研究旨在利用C. grandiflora乳胶蛋白酶制备的Cg-coagulant生产干酪凝块，并全面评价其理化性质、微生物安全、毒理安全性以及感官接受性。

研究人员从C. grandiflora乳胶中提取并冻干获得蛋白酶制剂，命名为Cg-coagulant，并以该制剂作为凝乳剂生产干酪（Cg-cheese），同时以商业动物凝乳酶（Coalhopar，含天然犊牛凝乳酶）制得的干酪和市售干酪凝块、乳清干酪为对照，系统开展了成分分析、重金属检测、微生物检验、质地剖面分析（texture profile analysis, TPA）、毒理学评估（细胞活力实验和皮肤斑贴试验）以及感官评价。结果表明，Cg-coagulant能够快速诱导牛乳凝固，形成的凝乳较商业凝乳酶更为致密；Cg-cheese的基本理化组成与商业凝乳酶干酪相近，但蛋白质含量略低、脂肪含量略高；质地分析显示Cg-cheese的硬度、内聚性和弹性显著低于商业凝乳干酪，更接近乳清干酪的颗粒状软质结构。毒理学方面，Cg-coagulant在低浓度下未显示细胞毒性，人类斑贴试验中虽有12.1%受试者出现轻微皮肤反应，但均为轻度且未报告强反应。微生物检验确认沙门氏菌、大肠杆菌和凝固酶阳性葡萄球菌均未检出，总大肠菌群数低于标准限值。感官评价中，Cg-cheese的所有属性接受度均超过75%，对比测试中50%的受试者认为其与商业凝乳干酪相当，47%认为更好，购买意愿积极。该研究的重要意义在于，首次系统证明了来自野生植物乳胶的Cg-coagulant可作为传统动物凝乳酶的有效替代品，能够生产具有独特质地且消费者接受度高的干酪，为开发可持续的植物源凝乳剂提供了新依据。

在技术方法上，研究人员的主要手段包括：乳胶经离心、透析和冻干制备Cg-coagulant；采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白谱；以偶氮酪蛋白（azocasein）为底物测定蛋白酶活性；采用刃天青还原法评估L929小鼠成纤维细胞活力；对91名健康志愿者（Fitzpatrick皮肤光型I–VI）进行48小时封闭式斑贴试验；通过目视记录凝固时间测定凝乳活性；按巴西规范以巴氏杀菌牛乳（10 L）制作干酪，比较Cg-coagulant与商业凝乳酶的产量和品质；采用凯氏定氮、索氏抽提等方法分析化学成分；重金属由独立认证实验室检测；微生物检验参照美国食品药品监督管理局（FDA）细菌学分析手册（BAM）和美国公共卫生协会（APHA）标准；质地使用TA-XT2i质构仪进行双循环压缩测试；感官评价采用9点快感标度法，由100名消费者完成。

**3.1 蛋白谱与蛋白酶活性**
SDS-PAGE显示Cg-coagulant蛋白条带分布在15–60 kDa范围，其中约25 kDa条带在雨季（3–5月）采集的乳胶中明显增强，且该时期样品的蛋白酶活性也显著升高，说明季节性环境条件影响乳胶中半胱氨酸蛋白酶的表达。此外，Cg-coagulant溶液在5°C储存24小时蛋白酶活性保持不变，而在27°C下活性降低20%。

**3.2 Cg-coagulant毒理学特征**
细胞活力实验表明，Cg-coagulant浓度低于125 μg/mL时对L929成纤维细胞无细胞毒性。斑贴试验中，91名受试者中有11人（12.1%）对Cg-coagulant呈现阳性皮肤反应，但均为轻度；按皮肤光型分层，光型IV受试者阳性率最高（36.4%），而光型V无阳性反应，统计分析显示光型IV与光型III相比具有更高的反应比值比（odds ratio = 6.40，95% CI: 1.59–32.40）。

**3.3 凝乳活性与干酪形成**
在牛乳凝乳测试中，Cg-coagulant（3 mg/mL）在11分钟内使牛乳凝固，明显快于商业凝乳酶Coalhopar（35分钟）和Buffalo（45分钟），且形成的凝乳更致密。以此条件制备的Cg-cheese产量为1350.5 g，高于Coalhopar干酪的1238 g。

**3.4 干酪表征**
Cg-cheese的水分、灰分与Coalhopar干酪相近，但蛋白质含量（19.72%）低于Coalhopar干酪（23.97%），脂肪含量（7.71%）则略高（5.62%）。重金属分析仅检出锑（0.06 mg kg^-1）和铜（0.51 mg kg^-1），均远低于巴西法规限值。质地剖面分析显示，Cg-cheese的硬度、内聚性、弹性和咀嚼性均显著低于商业凝乳干酪，而与乳清干酪接近，表明其具有更松软、颗粒感强的质地。

**3.5 感官分析**
感官评价中，Cg-cheese的颜色和外观接受度超过85%，香气和质地接近80%，风味接受度略低但仍在75%以上。与商业干酪凝块对比，50名受试者认为两者相似，32人认为Cg-cheese更好，15人认为好得多，仅3人认为较差。购买意愿调查显示，67名受试者表示可能或肯定会购买该产品。

**3.6 微生物分析**
微生物检验结果显示，Cg-cheese中沙门氏菌未检出（每25 g），大肠杆菌和凝固酶阳性葡萄球菌均低于10 CFU g^-1，总大肠菌群为3.5 × 10³ CFU g^-1，符合巴西食品安全标准。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Cg-coagulant的凝乳机制与凝乳酶类似，通过水解κ-酪蛋白使酪蛋白胶束聚集，但植物蛋白酶可能后续水解其他酪蛋白组分，导致凝乳网络较弱，从而产生类似乳清干酪的柔软质地。尽管Cg-cheese在质地上与传统干酪凝块存在差异，但感官接受度和购买意愿均较高，且未出现过度水解引起的不良风味。毒理学和微生物结果初步证实了Cg-coagulant作为食品级凝乳剂的安全性。研究结论强调，来自C. grandiflora乳胶的蛋白酶是一种有前景的植物源替代凝乳剂，能够生产具有独特质地和高消费者接受度的干酪，但仍需进一步优化工艺参数以消除少数受试者报告的轻微苦味，并建立标准化生产规范。