CircNFIB可抑制AC16心肌细胞中由缺氧/再氧合引起的铁死亡（ferroptosis），这一过程涉及miR-338-3p/GPX4信号通路

《Biochemical Pharmacology》：CircNFIB attenuates hypoxia/reoxygenation-induced ferroptosis in AC16 cardiomyocytes with involvement of the miR-338-3p/GPX4 pathway

　　

摘要

心肌细胞铁死亡（ferroptosis）会加剧心肌缺血/再灌注损伤，但其上游的非编码RNA机制仍未完全阐明。本研究探讨了核因子I B衍生的环状RNA（circNFIB）是否调节人类心室心肌细胞AC16细胞中由缺氧/再氧合（H/R）诱导的铁死亡，以及miR-338-3p/GPX4通路是否对此过程有贡献。通过Sanger测序验证了circNFIB的反剪接接头。研究了细胞活力、丙二醛（malondialdehyde）、细胞内Fe²⁺、硼双吡咯甲烷（BODIPY）581/591 C11氧化产物以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和转铁蛋白受体1（TfR1）蛋白的表达情况。H/R处理降低了circNFIB的表达和细胞活力及GPX4的水平，同时增加了脂质过氧化、细胞内Fe²⁺的积累和ACSL4的表达；铁死亡抑制剂ferrostatin-1部分逆转了这些变化。circNFIB过表达提高了细胞活力，减少了细胞内Fe²⁺的积累和脂质过氧化，部分恢复了GPX4蛋白的表达，并降低了ACSL4和TfR1的水平。circNFIB主要存在于细胞质中。在报告基因检测中，miR-338-3p降低了含有野生型circNFIB序列或GPX4 3′非翻译区（3′UTR）的报告基因的活性，而相应的突变报告基因则没有显著变化。H/R处理提高了miR-338-3p的表达，而circNFIB过表达则降低了其表达。miR-338-3p的过表达加剧了与铁死亡相关的表型，并部分抵消了circNFIB过表达所带来的保护作用。这些结果表明，circNFIB可减弱AC16细胞中的H/R诱导的铁死亡，其中miR-338-3p/GPX4通路对此过程有贡献。

引言

心肌缺血/再灌注（I/R）损伤会通过引发一系列相互关联的病理过程（包括氧化应激、Ca²⁺失调、炎症和线粒体功能障碍[1][2]，以及多种形式的调控性细胞死亡[3][4]，从而限制冠状动脉再灌注的治疗效果。这些过程导致心肌细胞丧失、功能恢复受损以及不良的心室重构，即便冠状动脉血流成功恢复也是如此[1][3]。因此，明确决定心肌细胞对再灌注损伤敏感性的分子通路对于开发基于机制的心脏保护策略至关重要。

铁死亡是一种依赖铁的调控性细胞死亡形式，由磷脂过氧化和抗氧化防御机制的失败引发[5][6]。其发生受氧化还原活性铁的可用性、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）介导的多不饱和脂肪酸进入膜磷脂的过程，以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）对脂质过氧化物的还原作用的影响[6][7][8]所调控。ACSL4促进多不饱和脂肪酸进入膜磷脂，从而增加可氧化脂质底物的量，增加细胞对铁死亡的敏感性[7]。因此，本研究将ACSL4作为脂质代谢相关的铁死亡指标进行检测。转铁蛋白受体1（TfR1）作为铁转运的主要介质以及实验系统中与铁死亡相关的膜标记物也被纳入研究[9]。实验性心肌I/R和心肌细胞H/R模型显示铁的积累和脂质过氧化的增加，而抑制铁死亡的措施则可以减轻心肌或心肌细胞的损伤[10][11]。然而，调控心肌细胞铁死亡的上游RNA机制仍不完全清楚。

环状RNA（circRNAs）通过反剪接形成，其末端通过共价连接而具有抗外切核酸酶降解的能力[12][13]。根据其序列和细胞内分布，circRNAs可以通过与微小RNA（miRNAs）、RNA结合蛋白及其他调控分子的相互作用来影响基因表达[12][13]。尽管已有研究表明一些circRNAs（如feACR和circBAZ1B）在心肌I/R损伤期间调节心肌细胞的铁死亡[11][14]，但这种调控过程的整体机制仍不甚明了。

先前的心脏研究表明，circNFIB（一种源自核因子I B（NFIB）基因的环状RNA）参与纤维化重塑。在心肌梗死后小鼠心脏和经转化生长因子-β（TGF-β）处理的心脏成纤维细胞中，circNFIB表达下降，而其恢复可通过miR-433相关信号通路抑制成纤维细胞的增殖[15]。后续研究进一步将circNFIB与内源性二氧化硫的抗纤维化作用联系起来，认为它通过抑制Wnt/β-连环蛋白和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路发挥这一作用[16]。然而，目前尚不清楚此处研究所分析的人类circNFIB转录本是否在再灌注相关的应激下调节心肌细胞的铁死亡。

利用CircInteractome和TargetScan进行的生物信息学筛选发现，miR-338-3p在circNFIB和GPX4 3′非翻译区（3′UTR）中具有预测的结合位点[17][18]。最近的实验研究表明，miR-338-3p直接靶向GPX4并加剧阿霉素引起的心肌细胞铁死亡[19]。因此，本研究探讨了circNFIB是否调节AC16细胞中的H/R诱导的铁死亡，以及miR-338-3p/GPX4通路是否对此过程有贡献。该方法结合了药物模型验证、ferrostatin-1的功能增强实验、亚细胞分离、双荧光素酶报告基因检测、miR-338-3p的功能增强实验和挽救分析。

章节片段

细胞培养和转染

人类心室心肌细胞AC16细胞系购自Procell Life Science & Technology Co., Ltd.（中国武汉）。细胞在含有10%胎牛血清（FBS；HyClone，Cytiva，美国犹他州洛根市）和1%青霉素-链霉素溶液（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）的Dulbecco改良Eagle培养基/Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12；Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）中培养，培养温度为37°C，处于湿润环境中。

circNFIB反剪接接头的验证及H/R相关铁死亡表型的建立

对扩增子进行Sanger测序后发现，测序结果覆盖了circNFIB的反剪接接头区域，并与circBase参考序列匹配（图1A），证实了本研究中检测的转录本的准确性。

随后将AC16细胞暴露于10小时的缺氧环境后，再恢复12小时的氧气供应。H/R处理降低了细胞活力，而ferrostatin-1部分恢复了细胞活力（图1B）。BODIPY 581/591 C11流式细胞术显示H/R处理后绿色荧光增强。

讨论

本研究支持circNFIB在调节人类心室心肌细胞AC16细胞中H/R相关铁死亡中的作用。H/R处理降低了circNFIB的表达，而circNFIB过表达提高了细胞活力，减少了细胞内Fe²⁺的积累和脂质过氧化，部分恢复了GPX4和TfR1的水平。ferrostatin-1部分减轻了H/R相关的表型变化，但在常氧条件下未显著改变FerroOrange信号。miR-338-3p

作者贡献声明

Rong Huang：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、概念构思。Jun Wang：数据可视化、实验设计、数据管理。Junchen He：数据可视化、方法设计、数据管理。Min Zhong：撰写修订、项目监督、资源协调、概念构思。

知情同意

不适用。

伦理审批

不适用。本研究使用的是商业可得的人类细胞系，未涉及人类受试者、人体组织、可识别的人类数据或动物实验。

手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来改进手稿的语言和可读性。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对出版物的内容负全责。

资助

本研究得到了中国广州市科学技术计划项目（项目编号：2024A03J0016）的资助。资助方未参与研究设计、数据收集、数据分析与解释、手稿撰写或决定论文发表。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。