STID：标准化传染病空间转录组分析的统一框架

《Cell Reports Methods》：Standardizing spatial transcriptomic analysis for infectious diseases with STID

　　

传染病空间转录组研究仍依赖于碎片化的数据分析流程。为此，研究人员开发了STID（传染病空间转录组学工具包，spatial transcriptomics toolkit for infectious diseases），这是一个基于Seurat生态系统并整合Python模块的传染病空间转录组分析标准化框架。STID提供了可扩展的感染特异性数据结构，并支持一系列完整分析，包括病原体背景校正、感染相关斑点（spot）与生态位（niche）鉴定、单样本生态位表征以及多样本比较和时序分析。STID可广泛应用于由细菌、病毒和寄生虫引起的传染病空间转录组数据，并能够在病原体感染和/或宿主响应生态位中系统表征其结构特征、细胞组成、分子功能及宿主-病原体相互作用。总体而言，STID为分析感染相关的空间转录组数据以及在天然空间微环境中解析宿主-病原体相互作用提供了一个可访问、可重复且可扩展的分析框架。

空间转录组技术为解析空间微环境的结构和功能特征提供了有力手段，但在传染病研究中，由于宿主-病原体互作的复杂性，通用分析工具难以有效解析感染样本的空间异质性，且缺乏针对病原体来源背景噪音去除、感染相关斑点/生态位识别、宿主-病原体互作解析及多样本系统比较的专用模块。为此，研究人员开发了STID（spatial transcriptomics toolkit for infectious diseases）——一个整合标准化流程、专用于传染病空间转录组分析的框架。STID基于Seurat生态系统，并整合Python模块，定义了扩展的感染特异性数据结构，涵盖病原体背景校正、感染相关斑点与生态位鉴定、单样本生态位表征、多样本比较与时序分析等功能。研究人员将其应用于肺泡棘球蚴病（alveolar echinococcosis, AE）、日本脑炎（Japanese encephalitis, JE）、结核病（tuberculosis, TB）、非洲锥虫病等多种细菌、病毒和寄生虫感染的空间转录组数据集，验证了STID在跨病原体类型、跨平台和跨物种数据中的适用性。研究结果表明，STID能够稳健地识别感染相关生态位，揭示病原体感染生态位与宿主响应生态位在空间上的分离及功能差异，解析宿主-病原体相互作用机制，并优先排序潜在治疗靶点。STID为传染病空间转录组分析提供了一个便捷、高效、可重复的统一框架，为病原生物学、免疫学和转化医学研究提供了计算支撑。

研究人员在开发STID过程中采用的关键技术方法包括：（1）整合Seurat与Python模块（如Scanpy、Squidpy）实现空间转录组数据的标准化预处理与格式互转（H5AD/Seurat RDS）；（2）开发病原体背景校正模块（CorrectBackground），支持对照样本模式和背景区域模式；（3）基于基因表达阈值和基因集评分的斑点检测策略（SpotDetect_Gene/SpotDetect_Geneset），结合ScanThreshold拐点分析确定阈值；（4）构建三种生态位识别模式（“foci”“aggregated”“dispersed”），分别采用NicheDetect_Lasso交互圈选、NicheDetect_STS的密度聚类与kNN连通分析、NicheDetect_Spot直接定义，并支持NicheExpand边界扩展；（5）整合空间梯度分析、细胞聚集指数、共定位分析（Squidpy/mistyR）、差异表达与富集分析（clusterProfiler）、细胞通讯分析（CellChat）、基因调控网络分析（NicheNet）、宿主-病原体蛋白互作推断（BLAST+STRINGdb）及时序基因模块鉴定（Mfuzz）等多项计算模块。研究使用了10个公开的空间转录组数据集，包括来自人鼠的脑、肝、心、肺和皮肤样本，涵盖慢性乙型肝炎（CHB）、人结核病、皮肤利什曼病（CL）等18例人类样本。

**STID建立了传染病空间转录组学统一框架**。STID整合输入/输出、预处理和下游分析模块，形成从原始空间转录组数据到单样本与多样本感染相关分析的端到端流程。它接受方格式和六边形空间布局数据，并支持H5AD与Seurat RDS双向转换。STID类扩展了Seurat类，新增STID_analysis槽，包含STID_info、meta_data_record、SingleSampNiche和MultiSampNiche四个模块，实现了分析结果的结构化存储。

**STID校正病原体来源的背景噪音并改进病原体感染斑点检测**。针对病原体背景噪音，STID提供对照样本模式和背景区域模式。在AE模型中，校正后非特异性信号显著降低，感染样本的空间聚集模式得以保留且增强；低载量样本校正后信号损失相对更大。利用ScanThreshold确定阈值后，非洲锥虫病模型中Tb927.6.4280阳性斑点的空间分布与已发表结果高度一致。在JE、鼠TB、人TB等模型中，病原体感染斑点的重建均与已发表空间分布吻合。宿主响应斑点与病原体感染斑点仅部分重叠，最强宿主响应与最强病原信号不一定重合，表明两者存在空间区室化。在无可靠病原信息的数据集（如VMC、VEE、肺炎克雷伯菌肺炎等）中，根据宿主响应特征可识别宿主响应斑点。

**STID识别具有不同空间模式的感染相关生态位**。基于感染相关斑点的空间聚集特征，STID建立“foci”“aggregated”“dispersed”三种生态位识别模式，并支持NicheExpand边界扩展。在AE模型中，采用“foci”模式结合H&E信息交互圈定生态位，发现病原基因表达从中心向边界递减，而宿主响应特征在边界附近达到峰值。在JE模型中，采用“aggregated”模式识别出病原体感染生态位和宿主响应生态位，二者空间重叠低，宿主响应生态位分布更广，且主要位于病原体感染生态位边界附近而非病原峰值区域。这些空间梯度模式在鼠TB、非洲锥虫病和人TB样本中得到验证。

**STID实现感染相关生态位的多尺度系统表征**。在AE模型中，感染相关生态位主要定位于肝中央静脉区，中性粒细胞、Spp1+单核细胞源性巨噬细胞（MoMFs）、单核细胞源性库普弗细胞（MoKCs）和成纤维细胞显著富集。细胞共定位与空间梯度分析显示中性粒细胞位于生态位中心，Spp1+ MoMFs位于边界附近。生态位内炎症基因（如S100a8、Ccl3、Ccr1、Ccr5）显著上调，GO富集表明涉及白细胞迁移和髓系白细胞活化。细胞通讯分析揭示中性粒细胞通过Il1a/Il1b-(Il1r1+Il1rap)、Cxcl2-Cxcr2、Ccl3/Ccl4-Ccr5信号轴协调免疫细胞募集，并激活Spp1+ MoMFs和成纤维细胞参与组织修复。宿主-病原体相关分析显示多数宿主基因与病原基因负相关，正相关基因富集于脂质代谢；蛋白互作推断提示病原蛋白可能影响宿主核糖体生物发生和蛋白质翻译，从而促进病原复制和免疫逃逸。

**STID揭示病原体感染生态位与宿主响应生态位的空间分离**。在JE模型中，两种生态位在空间分布、细胞组成、基因表达和功能上均存在显著差异。病原体感染生态位中TH和HB比例增加，NK和T细胞空间邻近增强，病毒基因（NS1、NS2a）上调，富集于神经功能相关通路；宿主响应生态位中FB、HB和MB_HB比例增加，单核细胞与血管相关细胞共定位增强，抗病毒和炎症基因（Ifng、Ccr1、S100a8）上调，富集于免疫应答和趋化相关过程。

**STID在比较分析中揭示对比性的空间生态位组织**。在AE模型中，比较早期（PI4d）与晚期（PI79d）发现：随疾病进展，病原体感染斑点比例增加，生态位从以中性粒细胞为主的急性炎症转向以Spp1+ MoMFs为主的慢性炎症、组织修复和重塑；中性粒细胞从早期生态位扩散至晚期旁观区。晚期生态位中Spp1+ MoMFs聚集增强，急性炎症基因（Saa1、Saa2）下调，Spp1和B细胞相关基因（Igkc、Jchain）上调。细胞通讯从IL1、CCL、TNF等炎症信号转向SPP1、VEGF、MIF等修复信号，SPP1信号轴主要由Spp1+ MoMFs驱动，协调成纤维细胞活化和肝细胞响应。

**STID在时序分析中揭示病原体感染的时空动态**。在JE感染模型中，整合多个时间点数据，STID刻画了病原体传播轨迹。组织水平上，日本脑炎病毒（JEV）推测从HB及邻近区域经TH向大脑皮层扩展；细胞水平上，传播轨迹主要沿少突胶质细胞→神经元→内皮细胞轴。宿主响应生态位中内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和单核细胞比例增加，并伴随免疫细胞浸润、血管重塑和纤维化。组织结构熵（OSE）评分随疾病进展显著变化，表明脑空间组织持续重塑。时序基因表达模式分析将动态基因分为四类（上凹、上凸、下凹、下凸），上凹基因富集于抗病毒过程，上凸基因富集于抗原加工呈递。Mfuzz聚类鉴定出PI3d和PI5d特异性模块，代表早期免疫激活向适应性免疫和组织重塑的转变。

在讨论部分，研究人员指出STID通过感染特异性数据结构与模块化分析框架，解决了传染病空间转录组分析中流程碎片化、缺乏标准化工具的问题。STID的病原体背景校正模块可有效降低背景噪音，但需注意过度校正风险；生态位多模式识别策略适应不同感染空间架构；多尺度分析揭示了生态位内的功能区室化。多样本比较和时序分析能够刻画疾病进展中的阶段特异性变化。STID适用于多种病原体、平台和宿主物种，但在单细胞分辨率、跨平台定量比较和超大规模数据处理方面仍存在局限。总体而言，STID建立了一个从原始数据到感染相关单样本和多样本分析的标准化、端到端工作流，其应用价值已在多个病原体类型、平台和宿主物种中得到验证，包括来自CHB、人TB和CL的18例人类样本，这些人类分析支持跨物种可行性，但不构成临床诊断性能的验证。随着空间多组学技术的发展，STID有望向多模态数据整合和建模方向扩展，为病原生物学、免疫学和转化医学研究提供计算基础。