《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：Proto-oncoprotein PAK4 is associated with nuclear accumulation of pro-oncogenic melanotransferrin and β-catenin in melanoma cells
编辑推荐：
• 黑素转铁蛋白（MTf）调控一个WNT相关蛋白网络。
• MTf与β-catenin共同出现于含PAK4的蛋白复合物中。
• 沉默PAK4选择性降低核MTf，而不降低总MTf。
• 尽管WNT3a可稳定β-catenin，核β-catenin仍对PAK4敏感
• 黑素转铁蛋白（MTf）调控一个WNT相关蛋白网络。
• MTf与β-catenin共同出现于含PAK4的蛋白复合物中。
• 沉默PAK4选择性降低核MTf，而不降低总MTf。
• 尽管WNT3a可稳定β-catenin，核β-catenin仍对PAK4敏感。
• MTf–PAK4轴与WNT通路输出增强相关。
论文主体解读：
黑色素瘤（melanoma）是来源于黑素细胞的高侵袭性恶性肿瘤，全球发病率上升，尤其在紫外线暴露较高地区。尽管靶向治疗和免疫治疗改善了部分临床结局，晚期黑色素瘤仍因肿瘤异质性、转移和耐药而治疗困难，因此阐明驱动其进展的分子机制十分必要。黑素转铁蛋白（melanotransferrin, MTf）是较早鉴定的黑色素瘤抗原之一，通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜，与转铁蛋白高度同源，并在较大比例黑色素瘤中高表达。既往功能研究提示MTf促进黑色素瘤细胞增殖、迁移、转移和肿瘤生长，并涉及WNT信号。N-myc下游调节基因1（NDRG1；转移抑制因子）与MTf呈拮抗关系。PAK4（p21-activated kinase 4；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，原癌蛋白）可磷酸化β-catenin（β-连环蛋白；WNT通路转录共激活因子）的丝氨酸675位点（Ser675），促进其稳定和核转位；importin β1（核输入蛋白β1）参与核运输。现有问题在于MTf入核机制未知，MTf与PAK4、importin β1及WNT/β-catenin通路输出的关系需阐明。研究人员因此采用MTf过表达和沉默的人黑色素瘤细胞，分析MTf与NDRG1关系，并检验PAK4或importin β1是否介导MTf及β-catenin的核积聚。
主要关键技术与方法（≤250字）：研究使用SK-Mel-28人黑色素瘤细胞系（美国典型培养物保藏中心ATCC）及稳定MTf过表达克隆hIF、hIE与空载体对照VA，稳定MTf沉默克隆B2与scrambled对照SCR；在有无WNT3a（WNT家族配体3a；100 ng/mL，48 h）条件下，以Western blot（蛋白质印迹）检测蛋白表达，以针对PAK4或importin β1的小干扰RNA（siRNA）进行沉默，以共免疫沉淀（co-IP）分析PAK4复合物，以共聚焦显微镜和ImageJ定量荧光强度、核信号及共定位，采用非配对Student’s t检验，p＜0.05为显著。
研究结果：
MTf过表达下调NDRG1，而MTf沉默在SK-Mel-28细胞中呈相反效应。Western blot显示，hIF和hIE中NDRG1降低，B2中NDRG1升高。
MTf过表达增加WNT共受体LRP6（低密度脂蛋白受体相关蛋白6；WNT共受体）和β-catenin，而WNT3a降低LRP6。Western blot显示MTf过表达提高基础LRP6和β-catenin，WNT3a处理后LRP6下降。
MTf过表达增加PAK4和cyclin D1（细胞周期蛋白D1；WNT下游促增殖蛋白），并与WNT3a处理后β-catenin Ser675磷酸化增强相关。Western blot显示PAK4、cyclin D1升高，WNT3a增强Ser675磷酸化信号。
MTf沉默上调NDRG1并下调LRP6。Western blot显示B2中NDRG1升高、LRP6降低，与过表达模型相反。
MTf沉默下调β-catenin、PAK4和cyclin D1。Western blot显示B2中上述蛋白降低；importin β1未见显著变化，探索性沉默importin β1未显示对MTf、β-catenin、PAK4或cyclin D1的一致降低作用。
PAK4可与MTf和β-catenin共免疫沉淀，MTf沉默降低其回收。co-IP显示MTf与β-catenin共同出现于含PAK4复合物中；该结果不能区分直接或间接结合，且回收量随MTf表达变化。
无WNT3a时PAK4沉默降低MTf过表达细胞β-catenin，而WNT3a在PAK4沉默下维持β-catenin。Western blot显示PAK4沉默降低hIF和hIE的基础β-catenin；WNT3a处理使总β-catenin维持。
无WNT3a时MTf过表达主要增加非核PAK4和β-catenin信号及其共定位，PAK4沉默减弱这些效应。共聚焦显微镜显示无WNT3a时信号以非核为主，MTf过表达增加总信号和共定位，PAK4沉默后降低。
有WNT3a时MTf过表达增加核PAK4和β-catenin，PAK4沉默减弱其核积聚。共聚焦显微镜显示WNT3a促进核PAK4、核β-catenin和共定位，PAK4沉默降低核信号。
PAK4沉默降低MTf沉默模型β-catenin，而WNT3a维持总β-catenin。Western blot和共聚焦显微镜显示B2中基础β-catenin较低，PAK4沉默进一步降低；WNT3a维持总β-catenin，但核β-catenin仍降低。
PAK4沉默降低MTf–PAK4共定位及核MTf积聚。Western blot显示PAK4沉默未一致改变总MTf；共聚焦显微镜显示核MTf、核PAK4及MTf–PAK4共定位降低。
PAK4沉默在MTf过表达和MTf沉默克隆中下调cyclin D1。补充实验的Western blot显示MTf与PAK4丰度随cyclin D1变化，PAK4沉默降低cyclin D1。
讨论部分总结：作者将MTf置于WNT/β-catenin网络之中：MTf升高伴随NDRG1降低及基础LRP6、PAK4、β-catenin、cyclin D1升高，MTf沉默呈相反变化，支持MTf增强经典WNT通路输出；MTf对NDRG1的抑制与既有的MTf–NDRG1拮抗关系一致。LRP6被描述为MTf改变细胞对WNT配体反应性的候选枢纽；WNT3a降低LRP6符合配体诱导的负反馈。MTf过表达增加基础β-catenin，沉默降低；WNT3a增加总β-catenin并覆盖MTf沉默对总池的影响，但核β-catenin仍对PAK4敏感，说明总β-catenin维持与核积聚可分离。MTf单独未显著增加Ser675磷酸化，WNT3a使该信号增强而MTf沉默削弱之，故数据未表明MTf直接刺激PAK4催化活性。PAK4沉默降低cyclin D1，支持PAK4位于MTf下游或经汇聚通路起作用。co-IP和共聚焦显示MTf与β-catenin出现于含PAK4复合物并与PAK4共定位，PAK4沉默降低核MTf和核β-catenin。讨论还联系乳铁蛋白（Lf）的核定位及WNT调控研究，并明确核MTf是否直接参与β-catenin依赖转录不属于本研究范围。其意义在于定义MTf–PAK4轴，将MTf表达升高与WNT相关蛋白水平及核积聚联系起来。
研究结论（原文结论段译）：总之，MTf调控SK-Mel-28黑色素瘤细胞中包括NDRG1、LRP6、PAK4、β-catenin和cyclin D1在内的WNT相关蛋白网络。MTf过表达与沉默的互 reciprocal模型支持MTf与基础WNT通路输出之间存在功能关系。一个主要新发现是，PAK4沉默选择性降低核MTf，而不一致降低总MTf。PAK4沉默也降低核β-catenin，即使WNT3a维持总β-catenin池。结合co-IP和成对共定位数据，这些结果定义了一个MTf–PAK4轴，将MTf表达升高与WNT相关蛋白水平联系起来，并确定PAK4是黑色素瘤细胞中MTf和β-catenin核积聚的重要决定因素。
