《Science Translational Medicine》：Single-nucleotide polymorphism–directed design of allele-specific antisense oligonucleotides for spinocerebellar ataxia type 3
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脊髓小脑性共济失调3型（SCA3），又称马查多-约瑟夫病，是最常见的常染色体显性小脑性共济失调，由ATXN3基因中的CAG重复扩增引起。突变蛋白易于聚集并产生毒性功能获得效应，而野生型蛋白作为去泛素化酶具有重要的神经保护作用。目前针对SCA3的治疗策略缺乏对突
脊髓小脑性共济失调3型（SCA3），又称马查多-约瑟夫病，是最常见的常染色体显性小脑性共济失调，由ATXN3基因中的CAG重复扩增引起。突变蛋白易于聚集并产生毒性功能获得效应，而野生型蛋白作为去泛素化酶具有重要的神经保护作用。目前针对SCA3的治疗策略缺乏对突变等位基因的特异性。识别与致病性CAG扩增连锁的单核苷酸多态性（SNP）为开发等位基因特异性治疗干预措施（如反义寡核苷酸（ASO））提供了有前景的途径。为解决这一问题，研究人员对来自德国、英国和葡萄牙的79名SCA3患者进行了等位基因特异性、靶向、多重纳米孔测序。研究人员鉴定了近200个多态性，并根据连锁不平衡将其分为三个单倍型块。这些SNP与CAG扩增密切相关。对研究人员亚队列的基因型建模表明，仅靶向来自不同单倍型块的两个SNP即可实现对大多数欧洲患者的等位基因特异性治疗。研究人员评估了17种靶向不同单倍型块SNP的候选ASO。其中7种ASO实现了超过65%的等位基因偏好性降低。在两种SCA3 iPSC来源的皮层神经元（AX1、AX2）中单次应用一种ASO，可使突变ATXN3减少高达90%。AX1中的毒性评估以及RNA测序分析未显示毒性或广泛转录扰动的证据。这些发现强调，表征杂合性率为选择性ASO疗法提供了宝贵机会。研究人员使用ASO进行的原理验证性靶向研究证明了在ATXN3中实施单倍型信息指导的等位基因特异性沉默的可行性。
**研究背景与问题**
脊髓小脑性共济失调3型（Spinocerebellar ataxia type 3, SCA3），又称马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease, MJD），是最常见的常染色体显性遗传性小脑性共济失调，全球患病率为每10万人1至5.6例。该病由ATXN3基因第10外显子中的CAG重复扩增引起，翻译为延长的谷氨酰胺束。野生型ataxin-3蛋白作为去泛素化酶具有重要的生理功能，而突变型蛋白则易于聚集并产生毒性功能获得效应，最终导致神经退行性变。因此，选择性靶向突变等位基因同时保留野生型蛋白的治疗策略具有显著优势。然而，目前SCA3的现有治疗策略缺乏对突变等位基因的特异性，而非选择性降低ATXN3水平可能损害野生型蛋白的正常功能。识别与致病性CAG扩增连锁的基因变异，如单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP），是开发等位基因特异性治疗干预措施（如反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotide, ASO））的关键前提。传统Sanger测序无法实现单个变异在等位基因上的定位，而单分子长读长测序技术（如Oxford Nanopore Technologies, ONT）能够直接对DNA长片段进行测序，从而确定变异是否位于同一条等位基因上，实现单倍型分型（haplotype phasing）。此前针对SCA3的等位基因特异性ASO靶点数量有限，限制了ASO的设计空间，而靶序列的长度、唯一性、可及性和碱基组成等均影响ASO疗效。因此，本研究旨在建立一种经济、可扩展的ATXN3等位基因特异性测序方法，系统鉴定与CAG重复扩增相关的SNP和单倍型块，并评估SNP靶向ASO在患者来源的神经元模型中选择性降低突变ATXN3的可行性。
**研究内容与结论**
研究人员对来自德国、英国和葡萄牙三个欧洲亚队列的79名SCA3患者进行了等位基因特异性、靶向、多重纳米孔测序。通过连锁不平衡（Linkage Disequilibrium, LD）分析，研究人员在ATXN3基因区域鉴定了近200个多态性，并将其划分为三个单倍型块（haplotype block A、B、C），这些SNP与CAG扩增密切相关。基因型建模表明，仅靶向来自不同单倍型块的两个SNP即可实现对大多数欧洲患者的等位基因特异性治疗。研究人员设计了17种靶向这些SNP的候选gapmer ASO，在SCA3 iPSC来源的皮层神经元中进行了功能验证。结果显示，7种ASO实现了超过65%的突变等位基因偏好性降低；在两种独立的iPSC来源皮层神经元（AX1、AX2）中，单次应用一种ASO可使突变ATXN3蛋白水平降低高达89%至90%。转录组分析和乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）毒性评估未显示明显毒性或广泛转录扰动。该研究证明了单倍型信息指导的等位基因特异性ASO沉默在ATXN3中的可行性，为SCA3及其他毒性功能获得性神经退行性疾病的精准治疗提供了概念框架。
**关键技术方法**
研究人员采用了等位基因特异性、靶向、多重纳米孔测序技术：首先利用LDlinkR和TOPMed数据库对ATXN3基因区域SNP进行LD分析，确定单倍型块；然后设计覆盖CAG重复和每块代表性SNP的2-kb扩增子，结合双组合条形码策略，对来自德国（29例）、英国（25例）和葡萄牙（25例）的79名SCA3患者DNA进行多重纳米孔测序。通过生信分析将变异分配至突变或野生型等位基因。此外，研究人员对Joseph谱系患者进行了全基因组纳米孔测序验证。功能验证中，将17种候选gapmer ASO（含LNA修饰）单次应用于SCA3 iPSC来源的皮层神经元（AX1、AX2），通过Jess Simple Western定量突变和野生型ataxin-3蛋白水平，并通过RNA测序评估转录组变化和脱靶效应。
**研究结果**
1. **LD表显示单倍型块与CAG重复扩增的关联**：基于TOPMed数据库和LDlinkR分析，研究人员确定了206个SNP，其中173个SNP构成与CAG扩增高度连锁的单倍型块A（MAF约0.24），18个SNP构成单倍型块B（MAF约0.38），3个SNP构成单倍型块C（MAF约0.48）。这些单倍型块中的SNP彼此间呈现最大连锁不平衡（R2=1）。
2. **ATXN3扩增子测序实现患者单倍型块分型**：研究人员设计了2-kb扩增子，覆盖CAG重复和八个可归属至三个单倍型块的SNP。通过对扩增子进行凝胶电泳分离突变和野生型等位基因并Sanger测序，验证了变异与CAG扩增的关联。两名Joseph谱系患者的全基因组纳米孔测序进一步确认扩增子可准确推断更大的单倍型块。
3. **等位基因特异性、靶向、多重纳米孔测序鉴定疾病相关SNP**：对79名患者进行测序后，所有患者突变等位基因上均可检测到SNP，其中76%携带所有三个单倍型块的变异（α、β、γ、δ）。德国、英国和葡萄牙亚队列中分别有76%、72%和68%的患者在至少一个单倍型块中为杂合子，可通过靶向相应SNP实现等位基因特异性治疗。
4. **相关单倍型块不改变疾病进展和发病年龄**：CAG重复长度与发病年龄呈显著负相关（R2=0.6374），但突变等位基因或野生型等位基因上不同单倍型块SNP的存在与否与发病年龄和疾病进展（以SARA评分评估）无显著关联。野生型等位基因CAG重复长度在不同单倍型块分组间存在差异，但该差异不影响疾病进展。
5. **候选ASO在SCA3 iPSC来源皮层神经元中特异性降低突变ATXN3**：研究人员设计了17种候选ASO，靶向15个SNP。在AX1细胞中，7种ASO（ASO3、ASO5、ASO7S、ASO8S、ASO12、ASO13、ASO14）在单次应用后14天使突变ATXN3蛋白水平显著降低超过65%，其中5种表现出显著的突变等位基因偏好性。ASO7/ASO8同一序列不同LNA翼长度疗效差异显著，短翼版本效果更好。在AX2细胞中，6种ASO使突变ATXN3降低66%至89%。由于AX2在单倍型块C为纯合子，ASO13表现出非选择性降低。
6. **深入ASO评估确定潜在先导候选物**：RNA测序显示，对照ASO、ASO3、ASO12和ASO14未产生显著差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），ASO5有6个下调基因，ASO7S和ASO13分别有84个和35个DEGs。预测的脱靶基因均呈下调，且不同ASO间无明显DEG重叠。LDH实验和形态学评估未显示急性细胞毒性。
**讨论与结论**
研究人员通过大规模SNP鉴定和单倍型分型，显著扩展了SCA3等位基因特异性ASO的靶点选择空间。尽管不同亚队列中SNP杂合性分布存在差异（如德国患者主要依赖单倍型块A，葡萄牙患者更多依赖单倍型块B），但靶向来自单倍型块A和B的两个SNP即可覆盖大多数欧洲患者。对于所有单倍型块均为纯合子的患者（28%），可考虑靶向未归属于单倍型块的罕见SNP（如rs12895357、rs56268847）或通过全基因组测序鉴定个体化靶点。ASO设计的优化（如LNA翼长度）对疗效具有决定性影响，RNA测序和LDH检测证实筛选出的先导ASO具有良好的耐受性。研究人员指出，iPSC来源的皮层神经元并非SCA3主要受累神经元类型，且单细胞培养模型不能完全反映年龄依赖性ataxin-3聚集，未来需在脑类器官和体内模型中进一步验证。总之，本研究建立的将可扩展单倍型信息SNP发现与患者来源神经元功能验证相结合的框架，不仅为SCA3提供了多个潜在等位基因特异性治疗靶点，也为其他毒性功能获得性神经退行性疾病（如亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化等）的精准治疗策略提供了可借鉴的范式。
