三阴性乳腺癌中葡萄糖依赖性细胞毒性反应：代谢背景与p38 MAPK相关调控的实验及转录组学证据

《Breast Cancer: Targets and Therapy》：Glucose-Dependent Cytotoxic Responses in Triple-Negative Breast Cancer: Experimental and Transcriptomic Evidence of Metabolic Context and p38 MAPK-Associated Modulation

　　

摘要专业翻译 背景 三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）表现出显著的代谢异质性，这可能影响治疗反应。本研究探讨了百里醌（thymoquinone）、光甘草定（glabridin）和甘草酸（glycyrrhizic acid）在葡萄糖剥夺和缺氧条件下是否表现出背景依赖性细胞毒性，以及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的药理学抑制是否改变这些反应。 方法 研究人员在常氧、葡萄糖剥夺和缺氧条件下，于二维单层培养中使用百里醌、光甘草定、甘草酸或多柔比星（doxorubicin）处理MDA-MB-231和MCF-7细胞。通过MTT法评估细胞活力，并使用SB203580联合处理探讨p38的参与。在MCF-10A细胞中评估选择性。同时评估了百里醌银纳米颗粒。对TCGA-BRCA基底样和受体定义的TNBC队列以及GSE118389单细胞TNBC RNA-seq数据进行了糖酵解、缺氧、p38 MAPK、上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）、干性和氧化应激特征的转录组分析。 结果 在MDA-MB-231细胞中，光甘草定在葡萄糖充足条件下表现出更强的细胞毒性，而甘草酸在葡萄糖剥夺期间变得更加具有细胞毒性。SB203580的作用因代谢背景而异，支持药理学推断而非直接验证的p38参与。多柔比星在缺氧条件下活性降低，而百里醌保留了细胞毒性活性。百里醌纳米颗粒未表现出明确的治疗选择性。转录组分析确定了糖酵解-缺氧关系。经错误发现率（false-discovery rate，FDR）校正后，在两种bulk TNBC队列中，较高的p38相关转录活性与升高的EMT评分相关。Hallmark敏感性分析进一步显示，p38高表达肿瘤中糖酵解、缺氧和EMT评分更高。单细胞分析发现了相似的代谢应激和适应性关联，但由于细胞仅来源于六个肿瘤，这些结果属于探索性发现。 结论 代谢背景影响了TNBC中的细胞毒性反应。这些发现支持进一步研究微环境适应性疗法，而p38相关机制需要直接验证。

论文解读

一、研究背景与目的

乳腺癌是全球女性中常见的多因素复发性恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因。三阴性乳腺癌（TNBC）约占乳腺癌的15%–20%，因缺乏可靶向的受体，表现出高侵袭性、预后差且治疗选择有限。肿瘤微环境通过基质细胞或恶性细胞分泌的细胞因子网络调控肿瘤生长和扩散。肿瘤具有内在和适应性的代谢多样性，能够在营养缺乏和应激环境中生长，这使得在肿瘤内或跨肿瘤统一靶向代谢的努力受到阻碍。葡萄糖是肿瘤的主要能量来源，高葡萄糖摄取的肿瘤生长和分裂迅速。同时，高代谢活性也创造了酸性、缺氧的微环境，而缺氧微环境反过来影响代谢状态。p38 MAPK与上皮-间质转化（EMT）、侵袭和转移相关，是关键的致癌标志物和预后标志物。然而，常规治疗策略并未充分考虑瘤内代谢异质性，特别是血管化良好区域与灌注不良区域之间葡萄糖可用性的差异。天然化合物如百里醌、光甘草定和甘草酸虽具有抗癌潜力，但其在代谢应激微环境条件下的疗效和选择性仍不完全清楚。因此，本研究旨在评估这些化合物在不同葡萄糖和氧气条件下的细胞毒性功效，评估癌细胞选择性，探讨p38 MAPK药理学抑制是否以葡萄糖和微环境依赖方式改变细胞毒性反应，表征绿色合成的百里醌银纳米颗粒（Thy-AgNPs）的细胞毒性活性，并利用TCGA-BRCA bulk转录组数据和GSE118389单细胞TNBC RNA-seq数据评估所观察到的代谢应激和p38相关适应性反应的临床和细胞相关性。

二、主要关键技术方法

研究人员使用了多种关键方法。体外实验采用MDA-MB-231（TNBC）、MCF-7（ER阳性）和MCF-10A（正常乳腺上皮）细胞系，在常氧、缺氧（0.1% O₂）和葡萄糖剥夺条件下进行药物处理，通过MTT法评估细胞活力，使用SB203580作为p38 MAPK药理学抑制剂进行联合处理。纳米颗粒方面，采用绿色合成法制备Thy-AgNPs，并通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDX）和紫外-可见吸收光谱进行表征。计算分析方面，利用TCGA-BRCA bulk RNA-seq数据（基底样队列142例，受体定义TNBC队列123例）和GSE118389单细胞TNBC RNA-seq数据（1,189个细胞，来源于6个原发肿瘤），采用人工筛选的标志基因特征对糖酵解、p38 MAPK信号、缺氧反应、EMT、干性和氧化应激进行通路评分，使用Spearman相关分析、中位数分层（p38高/低组）和Mann–Whitney U检验，并应用Benjamini–Hochberg错误发现率校正。

三、研究结果

MCF-7细胞中多柔比星、百里醌、光甘草定和甘草酸在不同微条件下的细胞毒性

在MCF-7细胞中，缺氧降低了多柔比星的效力，而葡萄糖剥夺影响甚微。百里醌在正常、葡萄糖剥夺和缺氧条件下的IC₅₀值相对稳定。光甘草定在葡萄糖剥夺下效力降低，在缺氧下降低更明显。甘草酸在正常条件下估算IC₅₀为84.6 μM，但置信区间较宽，在葡萄糖剥夺或缺氧条件下无法可靠估算。多柔比星在所有测试条件下IC₅₀值最低，其次为百里醌和光甘草定。

MDA-MB-231细胞中光甘草定和甘草酸的细胞毒性

在标准培养条件下，光甘草定在MDA-MB-231细胞中呈浓度依赖性细胞毒性，IC₅₀为1.90 μM，在MCF-10A细胞中IC₅₀为15.8 μM。甘草酸在标准条件下两种细胞系均未达到IC₅₀。在葡萄糖剥夺条件下，甘草酸在MDA-MB-231细胞中细胞毒性显著增加，估算IC₅₀为0.06 μM，而光甘草定在测试浓度范围内无法可靠估算IC₅₀。两种化合物在葡萄糖剥夺的MCF-10A细胞中均未达到IC₅₀。

MDA-MB-231细胞中多柔比星和百里醌在不同微条件下的细胞毒性

两种药物均产生浓度依赖性细胞毒性，多柔比星在所有测试条件下的IC₅₀值均低于百里醌。在葡萄糖剥夺条件下，百里醌在MDA-MB-231细胞中IC₅₀为11.7 μM，而在MCF-10A细胞中未达到可靠IC₅₀。在缺氧条件下，百里醌在MDA-MB-231细胞中的IC₅₀（11.3 μM）低于MCF-10A细胞（42.1 μM）。多柔比星在缺氧下效力降低，而百里醌的效力在葡萄糖剥夺和缺氧条件下均得以维持。

p38 MAPK抑制对乳腺癌细胞中百里醌、光甘草定和甘草酸细胞毒性的影响

SB203580（10 μM）联合处理在MCF-7和MDA-MB-231细胞中均未显著改变百里醌在常氧或缺氧条件下的细胞毒性，而多柔比星在常氧下未显著改变，但在缺氧下两种细胞系中均显著降低。SB203580未显著改变光甘草定在两种细胞系中正常或葡萄糖剥夺条件下的细胞毒性。在MCF-7细胞中，甘草酸细胞毒性同样未被SB203580显著改变。相反，在MDA-MB-231细胞中，SB203580在正常葡萄糖条件下显著增强甘草酸相关细胞毒性，但在葡萄糖剥夺条件下显著降低其细胞毒性。

Thy-AgNPs的表征与细胞毒性活性

DLS分析显示平均Z-均流体动力学直径为74.4 ± 5.26 nm，多分散指数（PDI）为0.2965 ± 0.1025，Zeta电位为?17.95 ± 1.50 mV。TEM显示主要为球形至近球形颗粒。EDX确认了银（Ag）信号的存在。Thy-AgNPs在正常条件下对MCF-7和MDA-MB-231细胞表现出细胞毒性，但在缺氧和葡萄糖剥夺条件下活性较低。Thy-AgNPs在正常条件下对MCF-10A正常乳腺上皮细胞也高度细胞毒性，因此未表现出明确的治疗选择性。

计算验证确定TNBC中的糖酵解-缺氧轴和p38相关EMT特征

在TCGA-BRCA基底样肿瘤中，糖酵解和缺氧评分呈强正相关，支持代谢应激表型的关联。基因水平分析确认糖酵解和缺氧特征与SLC2A1、LDHA和CA9等生物学相关标志物相关。p38 MAPK通路表达评分与糖酵解或缺氧无强关联，但与EMT相关特征更密切。将基底样肿瘤按p38 MAPK评分中位数分层后，p38高表达肿瘤的EMT评分显著高于p38低表达肿瘤（FDR校正p = 0.0059），而糖酵解、缺氧、干性和ROS/氧化应激评分无显著差异。在受体定义的TNBC队列中，p38高表达肿瘤同样显示显著更高的EMT评分（FDR校正p = 0.0021）。MSigDB Hallmark敏感性分析显示，p38高表达肿瘤中糖酵解、缺氧和EMT评分均显著更高。单细胞分析中，p38高表达细胞在糖酵解、缺氧、EMT、干性和ROS/氧化应激评分上均显著更高，但这些比较属于探索性发现，因为细胞仅来源于六个肿瘤。

四、讨论与结论

讨论部分指出，光甘草定和甘草酸在MDA-MB-231 TNBC细胞中表现出相反的葡萄糖依赖性反应，反映了TNBC的代谢可塑性。光甘草定在葡萄糖充足条件下活性更强，可能与其抑制PI3Kγ、CDC6下调及miR-148a/SMAD2轴相关；甘草酸在葡萄糖剥夺时活性显著增强，可能与营养应激下线粒体依赖和氧化还原平衡改变使其对线粒体应激更敏感有关。p38 MAPK抑制对甘草酸细胞毒性的影响呈葡萄糖依赖性：在正常葡萄糖条件下增强其活性，在葡萄糖剥夺条件下完全消除其活性，表明p38 MAPK可介导促生存和促凋亡信号，其作用高度依赖背景。百里醌在缺氧条件下维持效力，而多柔比星效力降低，这可能与百里醌影响氧化应激、caspase信号、Bcl-2家族蛋白、NF-κB和HIF-1α相关通路有关。转录组分析确定了糖酵解-缺氧代谢应激轴和p38相关转录活性与EMT特征的关联，但需注意这些关联不代表因果或直接生化验证。研究结论为：代谢背景影响了TNBC中的细胞毒性反应，这些发现支持进一步研究微环境适应性疗法，而p38相关机制需要直接验证。