巴拉圭冬青茎秆类胡萝卜素水相提取工艺的开发与优化

《Food Analytical Methods》：Development and Optimization of an Aqueous Method for Carotenoid Extraction from Sticks of Ilex paraguariensis

　　

巴拉圭冬青（Ilex paraguariensis）茎秆是富含生物活性化合物的农工副产品，尤其含有叶黄素（lutein）等类胡萝卜素。本研究开发并优化了一种水相提取方法，以水和食品级表面活性剂作为提取溶液，用于提取总类胡萝卜素和叶黄素。采用全因子2³中心复合设计对提取条件进行优化。优化后的参数（提取液中0.5%聚山梨醇酯，58℃水浴搅拌5 min）使每100 g茎秆可提取2.91 mg叶黄素，并伴随较高的抗氧化活性。与文献中基于丙酮和石油醚的常规穷尽提取法（exhaustive extraction method）相比，所提出的水相工艺在所述实验条件下总类胡萝卜素含量提高1.32倍。该结果表明相对于常规方法具有更高的类胡萝卜素回收率，但在比较结果时应考虑提取程序差异及潜在基质效应。此外，绿原酸类化合物在优化条件下也被高效提取。冻干提取物在室温、无真空、避光条件下储存五周，显示类胡萝卜素中等程度降解，而绿原酸类化合物、总酚、还原能力和DPPH抗氧化活性得以保留。利用大蜡螟（Galleria mellonella）进行的毒理学试验证实了提取物在中浓度下的安全性。所开发的水相工艺提供了一种以水和食品级表面活性剂替代有机溶剂的提取途径，具有潜在的环境优势，但需通过全面的可持续性评估进一步评价。液体和冻干提取物均显示出在食品、制药和化妆品领域的应用潜力。

巴拉圭冬青（Ilex paraguariensis）是南美洲重要的经济作物，其叶片和细枝被广泛用于生产chimarr?o、tereré和mate茶等产品，巴西是其主要生产国。在工业加工过程中，大量茎秆作为副产品产生，仅约10%得到商业应用，其余常被废弃。这些茎秆富含叶黄素（lutein）等类胡萝卜素（carotenoids）以及绿原酸类化合物（chlorogenic acids）等生物活性物质，具有较高的回收利用价值。然而，传统类胡萝卜素提取方法通常依赖丙酮、石油醚等有机溶剂，存在毒性较高、操作步骤繁多、耗时较长等问题，限制了其在可持续分析和大规模生产中的应用。因此，有必要开发一种绿色、高效的水相提取方法，以实现对这类农工副产物的增值利用。本研究以水和食品级表面活性剂聚山梨醇酯20（polysorbate 20）为提取介质，系统优化了从茎秆中提取类胡萝卜素和叶绿素酸类化合物的条件，并评价了放大生产、冻干、储存稳定性及提取物毒性，为副产物资源化提供了新的技术途径。

研究人员以巴西南里奥格兰德州Arvorezinha的yerba mate工业提供的干燥茎秆为原料，经粉碎后储存。采用完整2³中心复合设计优化水浴搅拌提取条件，自变量为聚山梨醇酯20的浓度（0.10%–0.50%）、提取时间（5–60 min）和温度（30–60 ℃），响应值包括总类胡萝卜素、还原能力（Folin–Ciocalteu法）和ABTS（2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）自由基清除能力。通过响应面模型和desirability函数确定最优条件，并在放大规模下进行验证。提取液经冻干后，采用UV–Vis分光光度法和HPLC-DAD定量目标化合物，以Galleria mellonella幼虫模型评估体内毒性，并在25 ℃、避光条件下监测五周的储存稳定性。

### 总类胡萝卜素提取的多变量优化

中心复合设计结果显示，聚山梨醇酯浓度和温度对总类胡萝卜素提取量具有显著的正线性效应，提取时间未显示独立显著效应，但时间与温度存在交互作用。通过desirability函数优化得到的最佳条件为0.5%聚山梨醇酯、58 ℃水浴搅拌5 min。实验验证得到总类胡萝卜素含量为34.4 mg（叶黄素当量）每100 g茎秆，还原能力为20.8 mg没食子酸当量（GAE）g^?1，ABTS自由基抑制率为86.2%，其中还原能力和抗氧化能力与模型预测值无显著差异，表明模型可靠。

### 放大与冻干提取物的制备

将实验室条件（1 g/30 mL）放大33倍后，总类胡萝卜素得率与实验室规模等效。进一步增加固液比至100 g/1000 mL时，叶黄素得率仍保持相似，故确定该条件用于后续研究。100 g茎秆经提取和冻干后获得9.41 g干提取物，其低含水量和低水活度表明冻干过程有效，有利于储存稳定性。

### 放大水平下液体与冻干提取物的表征

液体提取物中总类胡萝卜素（UV–Vis法）为34.71 mg/100 g，叶黄素（HPLC法）为2.91 mg/100 g，高于文献报道的常规水提法（0.8–0.95 mg/100 g）以及芹菜、生菜等常见蔬菜中的含量。采用传统丙酮/石油醚穷尽提取法所得总类胡萝卜素为26.11 mg/100 g，低于本方法的34.41 mg/100 g，这可能与溶剂分配、洗涤和皂化过程中的损失有关。绿原酸类化合物在提取物中主要以3-咖啡酰奎宁酸（3-CQA）和5-咖啡酰奎宁酸（5-CQA）等单咖啡酰奎宁酸异构体为主，提取效率优于常规水提取和乙醇提取。冻干提取物中的活性成分按茎秆折算低于液体提取物，可能与冻干降解及过滤截留有关，但该机制未在原研究中验证。

### 大蜡螟模型体内毒性

在Galleria mellonella幼虫模型中，冻干提取物的半数致死剂量（LD₅₀）为28.0 g kg^?1，对照组未出现死亡。该值高于多种植物提取物在相同模型中报道的毒性剂量，提示提取物在中等浓度下安全性良好，但与不同研究的比较需考虑材料、模型和评价标准的差异。

### 冻干提取物储存稳定性

五周储存期间，总类胡萝卜素呈下降趋势，最终保留约55%；绿原酸类化合物保持较高稳定性；还原能力出现波动但无显著整体下降；ABTS法测得的抗氧化活性持续下降68%，而DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基）法测得的活性仅下降不到10%。颜色参数b*和c*持续降低，总色差ΔE*在第一周即大于12，表明提取物颜色发生肉眼可感知的变化，主要与类胡萝卜素的降解有关。

讨论部分指出，水相-表面活性剂体系的高回收效率可能归因于聚山梨醇酯的增溶作用以及相对温和的提取条件，避免了传统方法中皂化与分配步骤导致的类胡萝卜素损失。不同活性成分在储存中的稳定性差异与其化学性质和冻干基质结构有关；ABTS和DPPH结果的差异则反映了两种自由基反应机制的不同。毒性试验结果为该提取物的生物安全性提供了初步证据。

研究结论可概括为：以热水和含聚山梨醇酯20的水溶液为基础的提取方法，是从巴拉圭冬青茎秆这一尚未充分开发利用的农工副产品中回收类胡萝卜素的有效策略。多变量优化确定了提高生物活性化合物回收率的关键条件，突出表面活性剂浓度和温度的重要影响。优化条件下的放大实验证明该提取程序在较大加工规模下可行，所得冻干提取物同时含有类胡萝卜素和绿原酸类化合物。与常规水提和传统类胡萝卜素提取方法相比，本方法具有更高的类胡萝卜素回收率。储存实验表明，冻干提取物在五周内保留了大部分类胡萝卜素和绿原酸类化合物，尽管抗氧化活性和颜色有所变化。此外，该提取物在Galleria mellonella模型中表现出低毒性，为其生物安全提供了初步证据。总体而言，该技术为巴拉圭冬青副产物的增值利用提供了可行方案，并为后续工艺验证、稳定性优化和生物活性产品开发奠定了基础。