鼻基底细胞扩增条件对气液界面培养原代鼻上皮分化及表型结局的影响

《Journal of Personalized Medicine》：Basal Cell Expansion Conditions Influence Differentiation and Phenotypic Outcomes in Primary Nasal Epithelia Grown at Air–Liquid Interface

　　

背景/目的：在气液界面（ALI）培养的原代气道上皮被广泛用于呼吸系统内表型建模及个体化功能检测。然而，用于建立ALI的培养条件差异显著，可能引入选择偏倚。研究人员旨在将基于肺外植体的ALI方案适配至经微创刷取获得的鼻基底细胞，并确定能够优化鼻刷检所生成原代上皮数量、同时保留供体特异性特征的扩增条件。方法：采用配对设计，对来自九名健康成年供体的原代鼻基底细胞进行不同方案变体的扩增。研究人员在扩增阶段系统性地改变两个因素：（a）补充Rho相关激酶（ROCK）与SMAD通路抑制剂；（b）在ALI分化前进行单次传代。结局指标包括获得形态良好、已分化的ALI上皮的可能性，以及与呼吸系统表型分析相关的功能性读数。结果：在不使用ROCK/SMAD抑制剂且不进行传代的条件下进行扩增时，单次尝试建立良好分化ALI上皮的概率最高。在成功建立的ALI培养中，来自同一供体的重复 inserts 显示出可比的CFTR表达和纤毛摆动频率；然而，功能性氯离子分泌仅能在部分上皮中被稳定检测到，且与低水平上皮凋亡相关。结论：在扩增阶段避免强烈的选择压力——即省略ROCK/SMAD抑制剂并尽量减少传代——可提高获得良好分化的原代鼻ALI培养的成功率，并可能保留上皮创始细胞中的细胞多样性。这些发现支持将患者来源的鼻ALI培养作为个体化呼吸系统表型分析与功能评估的稳健、可重复平台，应用于个体化医学。

鼻基底细胞扩增条件决定气液界面原代鼻上皮的分化与表型结局：一项系统评估研究解读

一、研究背景与问题提出

气液界面（ALI）培养系统是从气道基底细胞构建功能性呼吸上皮模型的核心技术平台。原代气道上皮经ALI分化后可呈现杯状细胞、纤毛细胞和基底细胞等天然上皮的典型细胞类型，甚至可通过单细胞分析检测到离子细胞（ionocytes）等稀有细胞类型。建立完整分化的ALI上皮需经历以下流程：从供体获取基底细胞、在浸没式贴壁培养中扩增、以足够密度接种至通透性 inserts 上形成致密单层、移除 apical 培养基建立ALI并诱导分化。

然而，原代人鼻基底细胞具有高度异质性，包含增殖能力与谱系定向状态各异的亚群。在体外扩增过程中，每次酶消化和重新贴壁均构成群体瓶颈，快速增殖、耐应激的克隆往往主导后续生长，导致克隆丰富度下降，培养体系偏向高复制适应性的细胞亚群，牺牲了可能对维持体内相似上皮组成和供体特异性表型至关重要的静止型或谱系偏向型祖细胞。药理学通路调控可放大这些选择效应：ROCK抑制虽能提高解离后存活率并加速克隆生长，但持续暴露会破坏细胞骨架结构、改变E-钙黏蛋白介导的黏附，最终可能触发凋亡；SMAD通路抑制则解除细胞周期与分化的生理性制动，虽支持基底细胞长期扩增，却使培养偏向生长增强、命运倾向改变的亚群。

既往研究已表明，扩增阶段是决定ALI表型的主要因素。不同实验室因坚持各自优化方案，导致跨中心结果可比性降低。鉴于鼻刷检获取的生物材料极为有限，研究人员试图探索：在扩增阶段使用ROCK/SMAD抑制剂，或引入一次额外传代，能否在不损害下游表型分析的前提下提高鼻源性ALI培养的产出率。

二、研究设计与核心发现

研究人员采用配对设计，从九名健康成年志愿者双侧鼻腔各取一刷基底细胞，分别使用两种扩增方案：改良角质细胞培养基（不含ROCK/SMAD抑制剂）与添加ROCK/SMAD抑制剂的PneumaCult-Ex Plus培养基。扩增达汇合后，半数细胞直接接种inserts（P0），其余细胞继续扩增并尝试一次传代后接种（P1）。共成功生成22个可存活ALI inserts，其中13个来自改良角质细胞培养基（7个P0、6个P1），9个来自ROCK/SMAD抑制剂条件（7个P0、2个P1）。

核心结论是：不使用ROCK/SMAD抑制剂且不传代的扩增方案，单次尝试获得良好分化ALI上皮的概率最高。两种培养基在P0阶段的细胞产出量和达汇合时间相当，但ROCK/SMAD抑制剂组在P1阶段仅一例成功。在成功分化的培养中，来自同一供体的重复inserts在CFTR表达和纤毛摆动频率上具有可比性；然而，功能性氯离子分泌仅在部分上皮中可稳定检测，且与低凋亡评分显著相关。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：鼻刷检获取基底细胞（每侧鼻孔一刷）；配对扩增方案比较（改良角质细胞培养基 vs. PneumaCult-Ex Plus加ROCK/SMAD抑制剂）；ALI分化培养；高速视频显微镜结合Sisson–Ammons Video Analysis（SAVA）软件测定纤毛摆动频率（CBF）与活动纤毛面积；微Ussing chamber系统进行双重复电生理记录，评估ENaC、CFTR及嘌呤能受体介导的氯离子转运；苏木精-伊红染色组织学半定量形态学评分（上皮层数、凋亡、气腔、杯状细胞四项参数）；Western blot检测CFTR蛋白糖基化异构体（CFTR-C与CFTR-B）。样本队列为九名健康成人志愿者，所有活细胞读数于2024年4至6月完成，蛋白与组织学分析于2025年1至7月完成。

四、研究结果

扩增培养生长特征

两种扩增培养基在P0阶段的细胞产出量相当（改良角质细胞培养基均值3.0×10⁵，ROCK/SMAD抑制剂组均值3.6×10⁵），P1阶段在角质细胞培养基中细胞数略降（均值1.6×10⁵）。P0培养中，12/14例在5–8天内达汇合；超过8天才达汇合的扩增培养中，6例中有4例未能在inserts上形成细胞层。成功分化并出现纤毛搏动的培养，P0平均分化时间为10天，P1为13天。

ALI上皮生成成功率

九名志愿者均至少获得一个具有纤毛搏动的ALI insert。两种扩增培养基各有7/9名供体在P0直接接种成功。P1传代后，改良角质细胞培养基在6例中成功生成ALI上皮，而ROCK/SMAD抑制剂组仅1例成功。

离子通道功能分析

22例具有纤毛搏动的inserts中，12例Ussing chamber记录显示氯离子通道活性极低或缺失（虽有ATP反应证实上皮存活），仅10例呈现健康供体预期的离子通道特征。改良角质细胞培养基来源的inserts在P0有5名志愿者、P1有2名志愿者呈现"健康"特征；ROCK/SMAD抑制剂组仅在P0有2例、P1有1例（来自同一志愿者两个inserts之一）呈现预期特征。同一insert的两个重复测量高度一致，表明观察到的转运特征反映供体固有上皮特性而非技术变异。

组织学凋亡评分与屏障功能关联

比较缺乏氯离子通道活性的inserts（黄色标记）与功能正常者（绿色标记），上皮层高度和杯状细胞密度分布相似，但9例缺乏可检测氯离子通道活性的inserts中有7例呈现高凋亡评分（2–3分），而5例功能正常者全部为低凋亡评分（0–1分）。高凋亡评分与渗漏性屏障和缺失氯离子转运显著相关。

CFTR蛋白表达

20例可分析inserts中，17例检测到完全糖基化的CFTR-C条带，表明大多数成功分化的上皮表达成熟CFTR，且与扩增培养基和传代次数无关。CFTR蛋白在整insert裂解液或Ussing chamber测量后回收的生物材料中均可检测到。

纤毛功能评估

活动纤毛面积变异较大，而CBF是更稳定的参数。CBF在同一供体的不同inserts间保持一致，且与扩增培养基或传代无相关性。

五、讨论与结论

既往研究已表明扩增条件对ALI结局的决定性作用：Awatade等人发现双SMAD抑制扩增来源的ALI上皮CFTR功能减弱；Saint-Criq等人比较不同分化培养基发现离子转运和CFTR调节剂反应存在显著差异；Ruiz García等人比较StemCell与Lonza培养基发现细胞组成不同；Lee等人则强调扩增是决定ALI表型的主要因素。本研究结果与之一致：ROCK/SMAD抑制剂和传代均未改善鼻刷检细胞转化为再生原代上皮的成功率，多数原代上皮在无抑制剂且P0条件下生成。

研究人员认为，部分上皮缺乏可检测氯离子通道活性的混杂因素是凋亡导致的渗漏性上皮屏障。呼吸上皮氯离子转运的驱动力通常由氯离子梯度产生，当上皮因凋亡而变薄、渗漏时，经CFTR的氯离子转运可能被被动扩散部分或完全掩盖。组织学凋亡评分与功能屏障状态强相关：高凋亡评分上皮持续表现为渗漏屏障和缺失氯离子转运，低评分者则维持紧密连接和稳健的CFTR介导离子通道活性。

ROCK/SMAD抑制剂培养中观察到的组织学凋亡增加，可能反映快速克隆扩增后的延迟应激反应。持续ROCK抑制破坏细胞骨架结构、改变E-钙黏蛋白黏附并促进胞质扩散，最终触发凋亡；SMAD抑制则解除TGF-β介导的上皮稳态调控。两者共同施加强选择压力，富集高增殖、耐应激克隆，同时悬置生理性分化信号，当这些细胞被迫进入ALI分化时，累积的结构和代谢应激表现为延迟凋亡，损害屏障完整性并掩盖潜在离子转运能力。

本研究局限性包括：队列规模（n=9）限制统计功效；ROCK/SMAD抑制剂方案在P0阶段多数培养未能生成功能活性上皮，限制了两方案间CFTR功能的系统比较。

研究结论：最大限度减少扩增阶段的选择压力——避免ROCK/SMAD抑制并限制传代——可提高生成适合下游表型分析的已分化ALI上皮的可能性。虽然少数ROCK/SMAD抑制剂培养保留了功能能力，但该方案的高失败率和相关凋亡凸显了以供体特异性生理表型分析为实验目标时保守扩增策略的重要性。从转化医学角度看，这些发现对开发用于个体化医学和功能性治疗诊断学的标准化患者来源气道模型具有直接意义，尤其对CFTR调节剂筛选至关重要——可重复的电生理读数对于准确的基因型-表型关联和药物反应预测必不可少。此外，最小化体外扩增期间的人工选择压力可能减少实验室间变异，促进更可靠的跨中心比较，加速患者来源模型向常规临床决策的转化。