靶标触发的指数扩增增强型 CRISPR/Cas12a 系统结合荧光猝灭侧向流检测用于鼠伤寒沙门氏菌的超灵敏检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Target-triggered exponential amplification-enhanced CRISPR/Cas12a system with a fluorescence-quenching lateral flow assay for ultrasensitive detection of Salmonella typhimurium

• 通过 TEA 系统建立了一种无目标 DNA 预扩增的 CRISPR/Cas12a 传感平台。• 与传统 CRISPR/Cas12a 系统相比，TEA 系统实现了 10⁶倍的信号增强。• TEA-FQLFA 系统实现了目标双链 DNA 的阿摩尔级检测（0.081 aM）。• TEA-FQLFA 系统实现了针对鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，检测限（LOD）为 6.94 CFU/mL。**引言**间隔寡核苷酸重复序列簇（CRISPR）相关系统由于其可编程的核酸识别能力、卓越的特异性以及对各种核酸的广泛适用性，迅速成为强大的分子诊断工具（Chertow, 2018; Kaminski 等，2021）。在各种 CRISPR 效应因子中，CRISPR/Cas12a 因其对非特异性单链 DNA（ssDNA）的独特靶标激活反式切割活性而备受关注（Chen 等，2018; Li 等，2018）。当 Cas12a-crRNA 核糖核蛋白（RNP）复合物特异性识别目标 DNA 时，Cas12a 的构象激活启动了 ssDNA 报告分子的附带切割，从而将分子识别事件转化为可检测的信号（Chen 等，2018; Stella 等，2017）。然而，传统的基于 Cas12a 的检测方法本质上存在催化周转率低和信号积累不足的问题，这导致其检测限（LOD）通常局限于飞摩尔至皮摩尔范围，从而限制了其在高灵敏度分子检测中的应用（Broughton 等，2020; Gootenberg 等，2017; Talebian 等，2024）。为了克服这一局限性，大多数高灵敏度 CRISPR 诊断平台整合了等温扩增技术——如重组酶聚合酶扩增（RPA）（Chen 等，2018; Liu 等，2021）、环介导扩增（LAMP）（Li 等，2019; Wu 等，2022）和滚环扩增（RCA）（Shan 等，2026; Yan 等，2023）——与 Cas12a 系统，以增加目标 DNA 的丰度和信号生成。为了方便即时检测（POC），Zhang 等人率先将 RPA-CRISPR 系统与侧向层析法（LFA）整合，提供简单便携的读数，促进其在资源有限地区的应用（Gootenberg 等，2018; Myhrvold 等，2018）。然而，这些基于目标 DNA 预扩增辅助的 CRISPR-LFA 平台通常存在固有的局限性，因为它们通常需要开管转移步骤，将反应产物引入 LFA 系统。尽管大多数扩增的目标 DNA 片段会被激活的 Cas12a 切割，但少量残留的 DNA 片段在试条测试期间不可避免地会暴露于周围环境中，从而增加了气溶胶介导的携带污染风险（Cao 等，2023; Li 等，2023, 2026）。因此，在保持高分析灵敏度的同时消除目标 DNA 预扩增，对于开发便携式、抗污染的 CRISPR 诊断平台至关重要。最近，开发了各种信号放大策略，以减少 CRISPR 诊断对目标 DNA 预扩增的依赖。例如，催化 DNA 回路（Li 等，2025c; Ren 等，2025）和核酸链置换网络（Gong 等，2021; Mo 等，2025）已被用于放大 Cas12a 介导的信号输出。虽然这些信号放大策略显著提高了分析灵敏度，但其复杂的核酸架构、精确的动力学调控和延长的反应过程增加了系统构建和性能优化的复杂性（Li 等，2025b）。相比之下，级联反应系统整合了 Cas12a 介导的可编程分子激活网络，提供了一种更高效的信号放大方法，且不需要目标 DNA 扩增（Deng 等，2024; Lim 等，2025, 2026）。在这些系统中，功能 DNA 组分作为可编程信号放大器，通常将中间体或无活性前体转化为活性单元，以持续激活 Cas12a，从而引发随后的级联反应。例如，Chen 等人报道了一种靶标触发的指数扩增（TEA）系统，其中初始的 Cas 激活事件被转化为持续的 Cas 激活过程（Chen 等，2025）。与传统的 DNA 扩增方法不同，这些策略通过单个分子识别过程放大下游催化事件，从而在没有产生大量扩增目标 DNA 产物的情况下实现显著的信号积累。理论上，这种靶标触发的信号放大机制为开发高灵敏度分子诊断平台提供了诱人的机会，同时保持操作的简单性并最大限度地减少气溶胶污染的风险。为了验证这种方法，我们将 TEA 系统与荧光猝灭侧向层析法（TEA-FQLFA）整合，用于超灵敏检测鼠伤寒沙门氏菌（*S. typhimurium*）。如图 1A 所示，Cas12a/crRNA1 复合物（RNP1）通过 PAM 依赖性结合以及 crRNA1 与靶序列之间的互补配对来识别双链 DNA（dsDNA），从而激活 Cas12a 的反式切割活性。激活的 RNP1 切割 TEA 放大器的环区，破坏茎环结构并释放嵌入的次级激活子链。这些激活子随后与 crRNA2 杂交以激活 RNP2，RNP2 切割额外的 TEA 放大器以释放更多激活子，从而建立自我强化的正反馈级联。通过将顺序杂交与迭代的 Cas12a 介导的切割耦合，TEA 系统实现了超越传统单阶段 Cas12a 检测的级联信号放大，使用荧光团 - 猝灭剂（FQ）探针时检测限（LOD）达到 1 aM，比传统 Cas12a 系统低六个数量级。为了将 TEA 介导的级联扩增转化为快速视觉读数，TEA 与荧光猝灭侧向层析法（FQLFA）整合（图 1B）。检测线（T 线）共同包被了抗地高辛单克隆抗体和 AIENPs，而对照线（C 线）含有 BSA- 生物素和 AIENPs。链霉亲和素功能化的超支化金包覆聚合物微球（HGPMs）被用作光学标记，因为它们的高消光系数提供强比色信号，而其宽吸收（300-800 nm）通过内滤效应（IFE）实现了 AIENPs 荧光的有效猝灭。在没有目标 dsDNA 时，完整的地高辛 -ssDNA- 生物素报告分子将 HGPMs 桥接至 T 线的抗体，导致 HGPM 积累、强比色信号和荧光猝灭。当存在目标 dsDNA 时，TEA 介导的报告分子切割破坏了这种桥接，减少了 HGPM 捕获，从而导致比色信号降低（关）和荧光恢复（开）。过量的 HGPMs 通过链霉亲和素 - 生物素相互作用在 C 线被捕获，以验证试条操作。利用 TEA 介导的固有信号放大和 HGPM 增强的灵敏度，提出的 TEA-FQLFA 实现了目标 dsDNA 的阿摩尔级检测（0.081 aM）以及在复杂食品基质中超灵敏检测鼠伤寒沙门氏菌，比色模式和荧光模式的检测限分别为 7.95 CFU/mL 和 6.94 CFU/mL。**部分摘要****材料**所有寡核苷酸，包括地高辛 -ssDNA- 生物素报告分子、荧光团 - 猝灭剂（FQ）报告分子、目标 dsDNA、TEA 放大器、crRNA1 和 crRNA2（表 S1），均由上海生工生物科技股份有限公司（中国上海）合成。EnEng? LbaCas12a (Cpf1) 和 10× NEBuffer r2.1 购自 New England BioLabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。柠檬酸钠、聚（马来酸酐 - 交替 -1- 十八烯）（PMAO）和四氯合金酸 (III) 三水合物 (HAuCl₄·3H₂O) 购自 Sigma?Aldrich**TEA 系统的构建**TEA 触发的级联信号放大原理如图 1A 所示。TEA 系统由两个 Cas12a/crRNA 核糖核蛋白复合物（指定为 RNP1 和 RNP2）、一个可编程放大器和一个荧光 - 猝灭剂（FQ）报告分子组成。最初，RNP1 识别目标双链 DNA（dsDNA）并激活其反式切割活性。激活的 RNP1 随后切割放大器的茎环结构，导致熔点降低**结论**总之，我们开发了一种 TEA-FQLFA 平台，用于超灵敏检测鼠伤寒沙门氏菌。TEA 通过级联 Cas12a 激活和增强的报告分子切割实现高效的信号放大，且无需目标 DNA 预扩增，而 HGPMs 优异的光学性能进一步提高了 TEA-FQLFA 的灵敏度。提出的平台对目标 dsDNA 表现出卓越的灵敏度，比色模式和荧光模式的检测限分别为 0.129 aM 和 0.081 aM，**CRediT 作者贡献声明**Yuanqian Xiong: 初稿撰写，数据整理，概念化。 Li Li: 正式分析，数据整理。 Jun Huang: 资源。 Xuan-ang Shen: 调查，正式分析。 Jiayi Sun: 调查。 Yuqian Guo: 调查。 Daofeng Liu: 资源。 Tongtong Ma: 审校与编辑，调查，概念化。 Xiaolin Huang: 项目管理，资金获取。 Yonghua Xiong: 审校与编辑，监督，资金获取，概念化。**伦理声明**本研究不涉及人类受试者、动物或感官评价。所有实验均使用商业购买的牛奶样品和实验室菌株进行。因此，无需伦理批准。**利益冲突声明**作者声明他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能影响本论文中报告的工作。**致谢**本研究得到了中国国家重点研发计划（2025YFD2100500），国家自然科学基金（32560601, 22574072, 和 32160599），江西省重点研发计划（20232BBG70030, 20232BCD44004），中央财政引导地方科学技术发展专项资金（江西省）（20252ZDD020002），以及 江西省重点研发项目（20243BBH81007）的支持。Yuanqian Xiong|Li Li|Jun Huang|Xuan-ang Shen|Jiayi Sun|Yuqian Guo|Daofeng Liu|Tongtong Ma|Xiaolin Huang|Yonghua Xiong