OSUAB-0284（284）作为金黄色葡萄球菌感染临床前候选药物的体外和体内活性研究

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：In vitro and in vivo activity of OSUAB-0284, a preclinical candidate for Staphylococcus aureus infections

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）仍是全球最致命的病原体之一。OSUAB-0284（284）是一种靶向细菌II型拓扑异构酶的新型小分子抗金黄色葡萄球菌药物。284以相似（平衡）的效力抑制DNA旋转酶（DNA gyrase）催化的超螺旋和拓扑异构酶IV（topoisomerase IV, TopoIV）催化的解链（半数抑制浓度IC₅₀分别为0.80和0.15 μM），并促进DNA旋转酶和TopoIV介导的单链DNA断裂（single-strand DNA breaks, SSBs）积累。284与20 bp DNA和S. aureus DNA旋转酶形成三元复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构阐明了其结合模式。284对100株近期S. aureus临床分离株显示显著活性，90%最小抑菌浓度（MIC₉₀）为0.25 μg/mL。自发耐药频率研究显示耐药选择率极低（<9.62 × 10^?10）。吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）体外研究及小鼠和大鼠体内药代动力学（PK）研究显示其具有利于进一步开发的性质。284在中性粒细胞减少小鼠大腿感染模型中有效，每日两次口服剂量≥50 mg/kg可使细菌菌落形成单位（CFUs）降低约1 log₁₀。大鼠初步安全性研究显示284在最高测试口服剂量1,000 mg/kg下耐受良好。284目前正作为新型抗金黄色葡萄球菌疗法进行临床前开发。

研究背景与目的：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）每年经皮肤软组织感染、血流感染、肺炎、心内膜炎和骨髓炎等造成显著发病和死亡，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）常多重耐药。一线万古霉素仅可静脉给药且副作用明显，达托霉素仅静脉给药，利奈唑胺长期耐受性欠佳，因此需要同时具有口服和静脉给药潜力、对多重耐药S. aureus有效的新疗法。DNA旋转酶（DNA gyrase）和拓扑异构酶IV（topoisomerase IV, TopoIV）是细菌II型拓扑异构酶，维持DNA拓扑状态并为细菌存活所必需。氟喹诺酮类（fluoroquinolones, FQs）靶向二者但存在交叉耐药；新型细菌拓扑异构酶抑制剂（Novel Bacterial Topoisomerase Inhibitors, NBTIs）结合位点不同于FQs，可规避FQ耐药。然而NXL-101因hERG抑制导致QT延长而停止临床开发，gepotidacin在S. aureus皮肤软组织感染试验中出现高MIC的MRSA分离株，BWC0977因输注部位血栓终止后以不同制剂重新开展试验。研究人员此前用二氧六环连接子降低碱性和脂性以减轻hERG抑制，获得先导化合物147（抗葡萄球菌活性好、hERG安全，但TopoIV抑制较弱、代谢稳定性欠佳）和143（双靶点更平衡、代谢更稳定，但hERG抑制强）。因此，本研究旨在整合147的安全性优势与143的双靶点抑制和代谢稳定性，鉴定临床前候选药物284，为抗S. aureus感染提供可继续开发的NBTI候选。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用S. aureus DNA旋转酶超螺旋抑制、TopoIV解链抑制及DNA断裂生化实验；以冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析284与20 bp DNA及S. aureus DNA旋转酶三元复合物结构（2.75 ?）；按CLSI方法测定最小抑菌浓度（MIC），使用100株近期美国临床分离S. aureus（JMI Laboratories，含左氧氟沙星敏感/耐药MSSA和MRSA）及实验室菌株ATCC 29213、USA300、CFI和NBTI耐药D83N、M121K；全基因组测序确认突变；自发耐药频率实验；吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）、hERG和心脏离子通道、人肝细胞/HepG2/K562/HL60及Comet实验；小鼠和大鼠药代动力学（PK）；中性粒细胞减少小鼠大腿感染模型；大鼠单次口服安全性及毒代动力学。

研究结果：
1. 284同时靶向S. aureus DNA旋转酶和TopoIV（284 targets both S. aureus DNA gyrase and TopoIV）。生化实验显示284浓度依赖性抑制野生型DNA旋转酶超螺旋（IC₅₀=0.80±0.38 μM）和TopoIV解链（IC₅₀=0.15±0.03 μM），TopoIV/DNA旋转酶IC₅₀比值为0.19；对D83N突变型DNA旋转酶在200 μM内无抑制。DNA断裂实验显示284主要促进DNA旋转酶和TopoIV介导的单链DNA断裂（SSBs），双链DNA断裂（DSBs）很少。
2. 冷冻电镜揭示284与DNA旋转酶的结合模式（Cryo-electron microscopy reveals the binding mode of 284 with DNA gyrase）。2.75 ? cryo-EM结构显示284以两种构象结合于预期NBTI口袋，氟萘啶基团插入DNA中央碱基间，吡嗪并噁嗪酮结合A68、V71、M75、M121形成的疏水口袋，连接子柔性且与鸟嘌呤形成弱或瞬时氢键，整体结合模式与gepotidacin相似。
3. 284对实验室菌株和临床分离株显示强抗S. aureus活性（284 exhibits potent anti-S. aureus activity in laboratory strains and clinical isolates）。对ATCC 29213、USA300、CFI的MIC≤0.25 μg/mL；对NBTI耐药D83N和M121K的MIC为1–4 μg/mL，低于gepotidacin的8–16 μg/mL；对映体425活性约弱4倍。100株近期美国临床分离株MIC₅₀/MIC₉₀=0.12/0.25 μg/mL，97株MIC≤0.25 μg/mL，对左氧氟沙星耐药株MIC₉₀=0.12 μg/mL，总体比gepotidacin强2倍，但MIC差异的临床意义未知。
4. 284抗菌谱窄，主要针对革兰阳性菌（284 displays a narrow antibacterial spectrum, primarily for gram-positive bacteria）。对S. epidermidis的MIC₉₀=0.25 μg/mL；对肠球菌中等活性且优于gepotidacin；对链球菌中等，对S. agalactiae较弱；对卡他莫拉菌和流感嗜血杆菌活性不一；对非结核分枝杆菌不强；对E. coli、A. baumannii、P. aeruginosa活性差；TolC缺陷Salmonella的MIC大幅降低，提示外排影响革兰阴性菌活性。
5. 284在8×～16× MIC浓度下耐药发展缓慢（Resistance to 284 is slow to develop at 8×–16× MIC concentrations）。5株S. aureus自发耐药频率均<9.62×10^?10，未观察到突变；ciprofloxacin在可测菌株中频率为2.27×10^?8至3.70×10^?8。作者指出需更全面耐药研究，包括更低浓度、连续传代和动态浓度。
6. 284具有良好吸收、分布、代谢和排泄（ADME）性质（284 displays favorable absorption, distribution, metabolism, and excretion properties）。多物种肝微粒体120 min几乎无代谢，小鼠和人肝细胞半衰期>240 min，兔肝细胞约8 min；血浆稳定>120 min；甲磺酸盐在pH 7.5 PBS中溶解度>200 μM；蛋白结合中等（大鼠未结合4%，其他10%–31%）；Caco-2和MDCK II显示中等渗透并提示外排；CYP抑制IC₅₀为47–60 μM或>100 μM，药物相互作用风险低。
7. 284不强力抑制心脏离子通道或其他常见人靶点（284 does not potently inhibit cardiac ion channels or other common human targets）。hERG IC₅₀=104 μM，较143改善约14倍；Qube六种心脏离子通道100 μM抑制<25%；SafetyScreen44中44个靶点100 μM无>50%抑制，乙酰胆碱酯酶抑制仅37%。
8. 284在人细胞实验中安全（284 is safe in assays using human cells）。原代人肝细胞100 μM内抑制<25%；HepG2高内容指标影响<20%；K562/K/VP.5和HL60/HL60/MX2中生长抑制弱（IC₅₀约131和123 μM），不靶向人拓扑异构酶IIα（TOP2α）；Comet实验40 μM无DNA损伤；人TOP2α切割实验无DNA切割。
9. 284在小鼠和大鼠中口服生物利用度好（284 is orally bioavailable in mice and rats）。小鼠甲磺酸盐IV清除低13.8–18.6 mL/min/kg，Vd 0.5–0.8 L/kg，口服生物利用度67%–91%，50 mg/kg口服暴露延长，大腿组织与血浆动力学相似；大鼠IV清除7.6 mL/min/kg，t_1/2 4.84 h，Vd 0.54 L/kg，口服生物利用度66%，Cmax 43–51 μg/mL。
10. 284在中性粒细胞减少小鼠大腿感染模型经IV和口服给药有效（284 is efficacious with IV and oral dosing in the neutropenic mouse thigh infection model）。MRSA ATCC BAA-1717（MIC 0.25 μg/mL）感染；IV 66.7 mg/kg TID相对2 h对照达抑菌；口服BID 50、100、150 mg/kg各约降低1 log₁₀ CFUs，与万古霉素50 mg/kg IV BID相似；探索性IV 10/30/50 mg/kg QID呈剂量依赖性，最高剂量抑菌。
11. 284在大鼠早期安全性研究中耐受性良好（284 has a promising tolerability profile in early rat safety studies）。单次口服50、250、500、1,000 mg/kg，观察4天，无临床体征，体重、增重、摄食和 gross pathology无影响；最高剂量未结合Cmax在雄/雌分别为9.5和11.4 μg/mL；更多研究进行中。

讨论部分总结：S. aureus尤其是MRSA限制治疗选择；NBTIs提供结构与机制创新，但hERG抑制和S. aureus获得性耐药阻碍进展。研究人员设计并合成284，为143的近似结构类似物，仅在DNA旋转酶结合稠环系统由CH改为N（吡啶并噁嗪酮改为吡嗪并噁嗪酮）。该单一修饰使284的hERG抑制较143降低约14倍，hERG IC₅₀为104 μM，约为S. aureus MIC₉₀的200倍，且不抑制其他相关心脏离子通道，是含噁嗪酮或噻嗪酮NBTIs中的有利例外。284对S. aureus TopoIV的抑制约比DNA旋转酶强5倍，显示相对平衡的双靶点抑制，而gepotidacin和147对TopoIV的抑制分别弱16倍和17倍。与143类似，更平衡的双靶点抑制与更低自发耐药频率相关；284在5株S. aureus中未选择出耐药变异株。284对NBTI耐药S. aureus包括临床相关GyrA D83N的MIC优于gepotidacin（1–4 vs 8–16 μg/mL），但D83N株MIC仍高于野生型亲本株，原因尚不清楚，表明284对TopoIV的改善不足以完全克服D83N突变型DNA旋转酶耐药。284抗葡萄球菌MIC₉₀为0.25 μg/mL（gepotidacin为0.5 μg/mL），对左氧氟沙星耐药株MIC₉₀略优（0.125 μg/mL）；抗菌谱偏向葡萄球菌、链球菌和肠球菌，革兰阴性菌活性降低与外排有关。cryo-EM显示284与gepotidacin整体结合模式相似；配对K562/K/VP.5和HL-60/HL-60/MX2细胞实验及Comet实验表明284不靶向TOP2α且不诱导DNA断裂。284的ADME和PK性质良好，多物种微粒体及人/小鼠肝细胞内在清除低，甲磺酸盐在小鼠和大鼠口服生物利用度约65%，支持体内疗效和初步毒理研究；小鼠中性粒细胞减少大腿感染模型中口服≥50 mg/kg BID约降低1 log₁₀ CFUs；大鼠单次口服至1,000 mg/kg耐受良好，计划开展多剂量范围探索研究。研究结论翻译：OSUAB-0284表现出良好的抗金黄色葡萄球菌活性、对TopoIV和DNA旋转酶的双靶向作用、低自发耐药频率、良好的PK、体内疗效，以及在体外和初步体内实验中的安全性。研究人员因此选择284继续临床前开发，并将在适当时候报告更多研究。