《Applied and Environmental Microbiology》：Chemical diversity analysis identifies inhibitory compounds in the secretomes of citrus-associated Bacillus spp. to the Huanglongbing pathogen, “Candidatus Liberibacter asiaticus,” and citrus root pathogens
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黄龙病是一种毁灭性且无法治愈的柑橘病害，与革兰氏阴性、韧皮部限制性且不可培养的细菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”（CLas）有关，该病菌由木虱Diaphorina citri传播。本研究的目标是从先前建立的柑橘相关微生物
黄龙病是一种毁灭性且无法治愈的柑橘病害，与革兰氏阴性、韧皮部限制性且不可培养的细菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”（CLas）有关，该病菌由木虱Diaphorina citri传播。本研究的目标是从先前建立的柑橘相关微生物菌株库中筛选出用于防控黄龙病及相关根部病原菌的高性能微生物候选菌株。候选菌株的选择基于其生物活性、基因组和代谢组学图谱。研究人员对18株芽孢杆菌分离物进行了针对Liberibacter crescens、CLas以及柑橘相关的疫霉菌属和镰刀菌属物种的拮抗活性筛选。系统发育分析将这些分离物分为四个种组：贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。其中，贝莱斯芽孢杆菌表现出最强和最广谱的抑制活性，其次是枯草芽孢杆菌。这种增强的拮抗潜力可能与其鉴定出的更多数量和更多样化的生物合成基因簇有关。值得注意的是，抑制CLas的菌株包括贝莱斯芽孢杆菌（CB0021和CB0909）和高地芽孢杆菌（CB0086）。在所有抑制CLas的菌株中均保守存在芽孢菌溶素和表面活性素的生物合成基因簇，表明它们在抑制CLas方面可能发挥作用。相应地，在贝莱斯芽孢杆菌（CB0027和CB0909）和枯草芽孢杆菌（CB0893）的生物活性组分中检测到了表面活性素，这支持了它们可能对生物活性有所贡献并在体外抑制L. crescens生长的观点，凸显了它们作为CLas管理候选化合物的潜力。总体而言，这项研究强调了微生物发现、筛选和表征作为识别可持续解决方案以管理黄龙病的重要策略。
研究背景与目的
黄龙病（Huanglongbing, HLB）是全球柑橘产业面临的一种毁灭性且尚无有效疗法的病害，由革兰氏阴性、韧皮部限制性、不可培养的细菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”（CLas）引起，并通过亚洲柑橘木虱Diaphorina citri传播。目前最有效的控制策略依赖于树干注射抗生素土霉素和链霉素，但长期使用可能导致抗生素耐药性和环境风险，因此亟需寻找替代或补充方案。鉴于植物相关微生物，尤其是芽孢杆菌属（Bacillus spp.），因其能产生多样的次生代谢产物而展现出作为生物防治制剂的巨大潜力，研究人员旨在从前期建立的柑橘相关微生物菌株库中，筛选出能够同时抑制CLas及其相关根部病原菌（如疫霉菌Phytophthora spp.和镰刀菌Fusarium spp.）的高性能菌株，并阐明其作用机制。
研究方法与技术
研究人员首先对18株柑橘来源的芽孢杆菌分离物进行全基因组测序、组装和注释，利用平均核苷酸同源性分析和系统发育树确定其分类地位。通过琼脂扩散法和微孔板法评估粗提物对Liberibacter crescens（CLas的可培养近缘种）和CLas（利用柑橘毛状根离体体系）的抑制效果。采用平板对峙法测试其对柑橘根部病原菌Phytophthora citrophthora、P. nicotianae以及Fusarium oxysporum、F. falciforme、F. solani的拮抗活性。利用antiSMASH和BiG-SCAPE软件预测和分析各菌株基因组中的次级代谢产物生物合成基因簇（BGC）。通过液相色谱-串联质谱联用技术结合特征分子网络（FBMN）分析分泌代谢物的化学多样性，并对活性菌株进行大规模发酵和生物活性导向的分离纯化，结合核磁共振波谱和质谱鉴定活性化合物。最后，用商业化的表面活性素验证其对L. crescens的抑制作用。
研究结果
四种不同的系统发育群
基于ANI值和系统发育分析，18株芽孢杆菌被分为六个种，归属于四个群：贝莱斯芽孢杆菌群（10株）、枯草芽孢杆菌群（3株）、短小芽孢杆菌群（包含高地芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，共3株）和蜡样芽孢杆菌群（2株）。
对Liberibacter spp.的拮抗活性
体外实验显示，贝莱斯芽孢杆菌粗提物对L. crescens的抑制圈最大，其中CB0909活性最强。在柑橘毛状根离体实验中，贝莱斯芽孢杆菌CB0021、CB0909和高地芽孢杆菌CB0086在两个独立生物学重复中均能显著降低CLas的种群数量。
对Phytophthora和Fusarium spp.的抑制作用
总体而言，贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌株对多种疫霉菌和镰刀菌表现出中度至强效的抑制活性。其中，贝莱斯芽孢杆菌CB0912对镰刀菌的抑制最强，而贝莱斯芽孢杆菌CB0909对P. citrophthora的抑制最强，枯草芽孢杆菌CB0742对P. nicotianae的抑制最强。
共有生物合成基因簇
所有抑制CLas的菌株（CB0021、CB0909和CB0086）均含有编码芽孢菌溶素和表面活性素的BGC，暗示这两种代谢物可能在CLas抑制中发挥关键作用。此外，贝莱斯芽孢杆菌拥有最多样化的BGC，包括多种已知抗菌活性的化合物编码基因。
化学多样性与活性化合物鉴定
代谢组学分析发现，gameXpeptide、表面活性素和杆菌烯这三个分子家族仅存在于抑制Liberibacter的芽孢杆菌群中。通过生物活性导向分离，从贝莱斯芽孢杆菌CB0027、CB0909和枯草芽孢杆菌CB0893的活性组分中鉴定出一系列表面活性素同系物。
表面活性素对L. crescens的作用
商业化的表面活性素能以浓度依赖的方式显著抑制L. crescens的生长，最低有效浓度为5 μg/mL。
结论与意义
本研究表明，柑橘相关的芽孢杆菌，特别是贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，具有强大的抗Liberibacter、疫霉菌和镰刀菌的潜力。综合分析揭示，菌株的拮抗活性与其BGC的丰富度和多样性密切相关。芽孢菌溶素和表面活性素是所有CLas抑制菌株共有的预测代谢物，且表面活性素在活性组分中被鉴定出并能直接抑制L. crescens，证实了其抗Liberibacter活性。最终，研究人员基于生物活性、基因组和代谢组学数据，推荐贝莱斯芽孢杆菌CB0021、CB0909和高地芽孢杆菌CB0086作为后续温室和田间试验的首选候选菌株，用于开发黄龙病的可持续管理方案。这项工作突显了微生物发现、筛选和表征对于寻找黄龙病可持续治理策略的重要性。
