多粘类芽孢杆菌固氮酶电子传递途径：cbiW编码的[2Fe-2S]铁氧还蛋白与pfoAB操纵子编码的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的鉴定与功能解析

《Applied and Environmental Microbiology》：Electron transfer to nitrogenase in Paenibacillus polymyxa

　　

摘要：固氮酶（nitrogenase）需要低电位电子来将N2还原为氨。固氮酶的直接电子供体是还原态的铁氧还蛋白（ferredoxin, Fd）和黄素氧还蛋白（flavodoxin, Fld）。为N2固定而还原Fd或Fld的酶主要包括丙酮酸:黄素氧还蛋白（铁氧还蛋白）氧化还原酶（pyruvate-flavodoxin (ferredoxin) oxidoreductase, PFOR）、铁氧还蛋白-NADP+还原酶（ferredoxin-NADP+ reductase, FNR）、Rhodobacter固氮蛋白复合物（Rhodobacter nitrogen fixation protein complex, Rnf）以及分叉电子传递黄素蛋白复合物（bifurcating electron transfer flavoprotein complex, Fix）。Paenibacillus polymyxa是研究固氮的模式菌株，但其向固氮酶的电子传递途径尚不清楚。在本研究中，研究人员表征了P. polymyxa中向固氮酶的电子传递途径。缺失分析表明，在15个编码Fd、Fld以及Fd/Fld还原酶的基因中，仅有cbiW基因和pfoAB操纵子导致固氮酶活性下降（分别为野生型的31%和37%）。同时缺失cbiW和pfoAB的三重突变体使固氮酶活性降低61%。元素分析和紫外-可见吸收光谱显示，由cbiW编码的纯化Fd蛋白是一个[2Fe-2S] Fd。该纯化的Fd蛋白能够在体外替代Klebsiella NifF（Fld），将电子从丙酮酸传递给Klebsiella固氮酶。pfoAB操纵子编码PFOR，由两个亚基组成。Klebsiella oxytoca NifJ（PFOR）能够支持ΔpfoAB突变体的固氮作用。这些发现表明，由cbiW编码的[2Fe-2S] Fd和由pfoAB操纵子编码的PFOR构成了向Paenibacillus固氮酶的电子传递途径。 重要性：革兰氏阳性兼性厌氧菌Paenibacillus polymyxa是一种模式固氮菌（diazotroph），其编码固氮酶的nif（固氮）基因已被用于改造酵母和植物。然而，向Paenibacillus固氮酶的电子传递途径尚不清楚。在本研究中，研究人员证明，由cbiW编码的Fd和由pfoAB操纵子编码的PFOR构成了向Paenibacillus固氮酶的电子传递途径。由cbiW编码的Fd是一个[2Fe-2S] Fd，而由pfoAB操纵子编码的PFOR是一个异源二聚体。相比之下，在许多革兰氏阴性固氮菌中，[4Fe-4S] Fd被广泛用作固氮酶的电子供体，而PFOR（NifJ）是同源二聚体。这些结果表明，革兰氏阴性与革兰氏阳性细菌之间向固氮酶的电子传递机制可能存在一些差异。所鉴定的P. polymyxa中的电子传递组分在改造真核生物方面具有巨大潜力。

论文解读：多粘类芽孢杆菌固氮酶电子传递途径的研究

一、研究背景与科学问题

生物固氮是将大气中的N₂转化为NH₃的过程，由固氮酶催化，在氮循环中扮演着至关重要的角色。固氮酶需要低电位的电子和ATP才能完成对N₂的还原。其直接的电子供体是还原态的两种低分子量蛋白：铁氧还蛋白（ferredoxin, Fd）和黄素氧还蛋白（flavodoxin, Fld）。负责还原这些电子载体的酶主要包括丙酮酸:铁氧还蛋白（黄素氧还蛋白）氧化还原酶（pyruvate:flavodoxin (ferredoxin) oxidoreductase, PFOR）、铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶（ferredoxin-NADP⁺ reductase, FNR）、Rhodobacter固氮蛋白复合物（Rhodobacter nitrogen fixation protein complex, Rnf）以及分叉电子传递黄素蛋白复合物（bifurcating electron transfer flavoprotein complex, Fix）。

尽管电子传递对于固氮至关重要，但在大多数已知的固氮微生物中，向固氮酶的电子传递途径尚未被阐明。目前仅在少数几种模式固氮菌中得到了较为清晰的描述，如Azotobacter vinelandii、Klebsiella oxytoca和Rhodobacter capsulatus。例如，在兼性厌氧菌K. oxytoca中，NifF（一种Fld）和NifJ（一种单亚基的PFOR）构成了从丙酮酸到钼固氮酶的特定电子传递链。而在好氧菌A. vinelandii中，则涉及Rnf和Fix复合物。

Paenibacillus polymyxa是一种革兰氏阳性、兼性厌氧、产芽孢的固氮菌，属于一个包含超过25种固氮物种的大属。其nif基因已被成功应用于工程化改造大肠杆菌、酵母甚至植物，显示出巨大的农业生物肥料应用潜力。然而，作为研究固氮的重要模式生物，P. polymyxa中向固氮酶传递电子的具体通路却完全未知。因此，揭示其独特的电子传递机制，不仅有助于理解不同细菌（尤其是革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌）在固氮电子传递上的进化差异，也为进一步优化和设计真核生物（如作物）的固氮能力提供了理论基础和潜在元件。

二、主要研究方法

为了鉴定P. polymyxa中参与固氮电子传递的关键组分，研究人员采用了以下关键技术：

1. 1.
   转录组数据分析：利用已有的P. polymyxa WLY78菌株在固氮条件（-NH₄⁺, -O₂）和非固氮条件（100 mM NH₄⁺ + 21% O₂）下的全基因组转录谱数据，筛选在固氮条件下显著上调表达的基因，以此锁定候选的电子载体及其还原酶。
2. 2.
   基因敲除与回补分析：采用同源重组方法，分别构建了多个候选基因（包括编码Fd、Fld及Fd/Fld还原酶的基因）的框内缺失突变体。随后，通过测量各突变体的乙炔还原活性（即固氮酶活性），评估每个基因对固氮的贡献。对表型显著的突变体，进一步构建回补菌株进行功能验证。
3. 3.
   异源互补实验：将来自K. oxytoca的nifJ和nifF基因分别引入P. polymyxa的相关突变体中，检验这些外源蛋白能否替代内源蛋白的功能，从而探究电子传递组分的物种特异性。
4. 4.
   蛋白表达、纯化与体外生化重构：将目标基因（cbiW）在大肠杆菌中进行异源表达并纯化得到目的蛋白。通过元素分析（测定Fe和S含量）和紫外-可见吸收光谱确定其辅基类型。最后，利用K. oxytoca的nifF缺失突变体细胞粗提液作为反应体系（提供固氮酶、PFOR等），通过添加纯化的Fd蛋白，在体外重构电子传递链，检测其是否能替代NifF传递电子给固氮酶。

三、主要研究结果

1. 鉴定编码Fd、Fld及Fd/Fld还原酶的候选基因

通过基因组注释，研究人员发现P. polymyxa WLY78含有4个Fd编码基因（cbiW, fdx, fer, lutB）、4个Fld编码基因（fldA, fldB, flr, wrbA）以及24个编码潜在Fd/Fld还原酶的基因。结合转录组数据分析，研究人员重点关注了在固氮条件下高度上调的基因，其中包括2个Fd基因（cbiW, fer）、2个Fld基因（fldA, flr）以及11个Fd/Fld还原酶编码基因（如pfoAB操纵子等）。

2. cbiW编码的Fd参与固氮

通过分别敲除4个上调的Fd/Fld基因，发现只有cbiW基因的缺失导致了固氮酶活性的显著降低（降至野生型的31%）。回补cbiW基因可恢复其活性。尽管cbiW最初因其序列相似性被注释可能与维生素B₁₂合成有关，但外源添加维生素B₁₂并不能恢复ΔcbiW突变体的活性，证实其作用与维生素B₁₂无关，而是直接参与电子传递。

3. pfoAB操纵子编码的PFOR参与固氮

在11个上调的Fd/Fld还原酶编码基因中，仅有pfoAB操纵子的缺失导致了固氮酶活性的显著降低（降至野生型的约63%）。pfoAB编码一个由A和B两个亚基组成的PFOR，这与许多已知固氮菌（如K. oxytoca）中单亚基的NifJ不同。这是首次报道双亚基结构的PFOR参与固氮电子传递。

4. cbiW与pfoAB共同构成一条主要的电子传递途径

构建的ΔcbiWΔpfoAB三重突变体，其固氮酶活性相比单一缺失突变体进一步降低至野生型的39%，表明这两个基因在电子传递中协同作用。回补该三重突变体可完全恢复其活性。此外，来自K. oxytoca的单亚基NifJ（PFOR）能够成功替代P. polymyxa的双亚基PFOR（PfoAB），恢复ΔpfoAB突变体的固氮活性，暗示这两种结构迥异的PFOR在功能上可以互换。

5. Fd 3411蛋白的特性鉴定

纯化的由cbiW编码的Fd蛋白（命名为Fd 3411）呈棕色，其紫外-可见吸收光谱在约320 nm和420 nm处有特征峰，并在500 nm和550 nm附近有肩峰，这是典型的[2Fe-2S]簇蛋白的特征。元素分析显示其Fe与S的摩尔比约为2.35:1，进一步确认其为[2Fe-2S]铁氧还蛋白。

6. 体外重构电子传递链

在K. oxytoca的ΔnifF突变体（缺乏天然的Fld电子供体）的细胞粗提液中，添加纯化的P. polymyxa Fd 3411蛋白，可以显著刺激其固氮酶活性（从7.26提升至26.02 nmol C₂H₄/mg protein/h）。这直接证明了Fd 3411能够被K. oxytoca的NifJ（PFOR）还原，并将电子传递给K. oxytoca的固氮酶，即它在体外成功替代了NifF的功能。

7. 跨物种电子传递的特异性

有趣的是，尽管P. polymyxa的Fd 3411能在体外与K. oxytoca的NifJ配合工作，但反过来，在P. polymyxa体内，来自K. oxytoca的NifF（Fld）却无法回补ΔcbiW突变体的固氮缺陷。这表明P. polymyxa的PFOR（PfoAB）可能无法有效还原K. oxytoca的NifF，揭示了电子供体与受体之间存在一定的物种特异性，这可能源于两种细菌在PFOR和固氮酶结构上的差异。

四、讨论与结论

讨论总结：本研究首次阐明了P. polymyxa中向固氮酶的电子传递途径。尽管研究人员系统性地敲除了15个在固氮条件下上调的候选基因，但仅有cbiW和pfoAB的缺失显著降低了固氮酶活性，且双重缺失的效果大于单一缺失。这表明由cbiW编码的[2Fe-2S] Fd和pfoAB编码的双亚基PFOR构成了一条重要的电子传递路径。然而，双重缺失并未完全消除活性（仍保留约39%），暗示P. polymyxa中存在多条冗余的电子传递途径，这与A. vinelandii等模式菌株的情况类似。值得注意的是，与许多革兰氏阴性固氮菌偏好使用[4Fe-4S] Fd不同，P. polymyxa使用的是[2Fe-2S] Fd，这可能是革兰氏阳性菌的一个特点。此外，其PFOR为异源二聚体结构，也区别于常见的单亚基NifJ，反映了固氮电子传递机制的多样性。

研究结论：本研究证明，P. polymyxa中的cbiW基因和pfoAB操纵子参与固氮。由cbiW编码的Fd 3411蛋白是一个[2Fe-2S] Fd，而由pfoAB操纵子编码的PFOR由两个亚基组成。由cbiW编码的Fd 3411和由pfoAB操纵子编码的PFOR构成了向P. polymyxa固氮酶的一条电子传递途径。由于cbiW和pfoAB的缺失仅导致固氮酶活性降低而非完全丧失，表明P. polymyxa中存在不止一条向固氮酶传递电子的途径。研究所鉴定的这些电子传递组分在工程化改造谷类作物方面具有巨大潜力。