单细胞转录组学揭示多囊卵巢综合征中Rora相关颗粒细胞不完全黄体化与脂质代谢重编程

《International Journal of Women's Health》：Single-Cell Transcriptomics Reveals Rora-Associated Aberrant Granulosa Cell Differentiation in Polycystic Ovary Syndrome

　　

引言 多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）以卵泡发育停滞为特征，但颗粒细胞（granulosa cell，GC）分化受损的分子基础仍未完全阐明。
方法 研究人员构建了脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）诱导的PCOS样小鼠及匹配溶剂对照卵巢的单细胞转录组图谱，并利用空间转录组学作为主要细胞类型注释的正交参考，随后深入分析GC异质性。整合了拟时序推断、共表达网络和调控子活性分析，并在独立人类GC数据集中验证结果。此外，进行了计算机模拟Rora扰动、细胞–细胞通讯分析和药物重定位。
结果 研究人员鉴定出一类黄体化壁层GC亚群，具有强Rora调控子激活，称为Rora–regulon–active GCs（Rora调控子活跃型颗粒细胞）。该亚群在PCOS中显著富集，并在独立人类GC数据集中可重复观察到。Rora–regulon–active GCs表现出不完全黄体化表型并伴随脂质代谢重编程。计算机模拟Rora敲低部分重构了GC分化轨迹，并将PCOS偏倚的亚群组成向对照转变，伴随代谢转录程序的一致变化。细胞–细胞通讯分析提示基质细胞来源的Mdk–Sdc1信号，并提示可能由Vegfa等配体介导的与巨噬细胞的额外串扰。计算机模拟药物重定位优先筛选出盐酸甜菜碱（betaine hydrochloride）和贝派地酸（bempedoic acid）作为候选治疗药物。
讨论 该研究描绘了与PCOS相关的Rora相关异常GC分化程序，提出该异常程序可能是PCOS相关卵泡停滞的潜在细胞基础，并为精准靶向治疗提供机制和转化线索。
关键词：多囊卵巢综合征（PCOS）；基因调控网络；药物重定位；计算生物学与生物信息学；分子生物学；虚拟敲低。

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种常见且异质性显著的内分泌–代谢疾病，以高雄激素血症、排卵功能障碍和多囊卵巢形态为特征，并伴随肥胖、血脂异常、糖稳态受损及心血管代谢风险增加。卵泡发育停滞被认为是PCOS核心病理特征之一，与颗粒细胞（granulosa cell，GC）成熟受损密切相关；PCOS卵巢GC存在异常增殖、分化缺陷及细胞死亡程序失调，可能促进卵泡发生停滞和未成熟卵泡累积。既往批量转录组研究难以解析GC内部异质性和动态分化，PCOS中GC分化受损的分子调控程序仍缺乏系统认识。视网膜酸受体相关孤儿受体α（Rora）此前被报道参与能量代谢和生物节律转录调控，而PCOS常见代谢紊乱，为研究其在GC分化中的潜在作用提供了依据。
研究人员基于公开转录组数据开展再分析，未产生新的实验数据；构建小鼠卵巢单细胞转录组图谱并以空间转录组作为主要细胞类型注释参考，系统刻画GC异质性，整合拟时序推断、共表达网络和调控子活性分析，鉴定出PCOS富集且以Rora调控子活性增强为特征的Rora–regulon–active GCs（Rora调控子活跃型颗粒细胞），并在独立人类GC数据集中验证其富集。该亚群表现为不完全黄体化表型并伴随脂质代谢重编程；计算机模拟Rora敲低可部分重塑GC分化轨迹，并使PCOS偏倚的亚群组成向对照转变，伴代谢转录程序一致变化。细胞通讯分析提示基质细胞来源的Mdk–Sdc1信号及与巨噬细胞之间可能由Vegfa等配体介导的串扰；药物重定位优先筛选出盐酸甜菜碱（betaine hydrochloride）和贝派地酸（bempedoic acid）作为候选化合物。该研究从细胞状态层面提出PCOS相关卵泡停滞的潜在细胞基础，并为机制研究与精准靶向治疗提供线索。
关键技术方法概括：研究使用GSE268919小鼠卵巢单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）数据、GSE240271 Slide-seq空间转录组数据（GSM7689279对照与GSM7689280 hCG 0 h样本）、GSE240688人卵泡液scRNA-seq数据及GSE98595人黄体化GC微阵列数据（3例对照、5例PCOS）。分析包括Scanpy质控、Harmony整合与Leiden聚类；稳健细胞类型分解（Robust Cell Type Decomposition，RCTD）空间解卷积；Palantir、DPT、Monocle3、PAGA和CellRank拟时序与拓扑分析；高维加权基因共表达网络分析（high-dimensional weighted gene co-expression network analysis，hdWGCNA）；单细胞调控网络推断与聚类（single-cell regulatory network inference and clustering，SCENIC）及AUCell；CellOracle和scTenifoldKnk虚拟敲低；CellChat与NicheNet细胞通讯；drug2cell药物重定位；AUCell与ssGSEA外部验证。
研究结果：
卵巢单细胞转录组图谱与主要细胞类型注释（Ovarian Single-Cell Transcriptomic Atlas and Major Cell-Type Annotation）：经严格质控保留61,369个细胞，注释为B细胞、内皮细胞、上皮细胞、GC、巨噬细胞、NKT细胞、中性粒细胞、卵母细胞、血管周细胞、基质细胞和卵泡膜细胞等11类；RCTD空间映射与原始空间注释高度一致，支持注释可靠性，GC为两组中最丰富细胞群。
颗粒细胞重聚类鉴定六个亚群（Granulosa Cell Reclustering Identifies Six Subpopulations）：GC重聚类得到GC0–GC5，注释为卵丘GC（GC0）、Prss23⁺ GC（GC1）、增殖GC（GC2）、黄体化壁层GC（GC3）、壁层GC（GC4）和原始GC（GC5）；PCOS中GC1、GC2、GC3和GC5比例增加；Augur分析显示GC5、GC0和GC3对PCOS–对照转录扰动最敏感，GO富集显示各亚群功能程序不同。
颗粒细胞动态发育轨迹（Dynamic Developmental Trajectory of Granulosa Cells）：Palantir、Monocle3和DPT拟时序结果高度一致，PAGA与CellRank支持分支发育格局；GC5为根状态，轨迹1终止于GC3，轨迹2终止于GC0。
hdWGCNA揭示颗粒细胞分化中的阶段特异性共表达模块（hdWGCNA Reveals Stage-Specific Co-Expression Modules During Granulosa Cell Differentiation）：构建11个共表达模块，M9对应GC5，M8对应GC3，M10和M2对应GC0；轨迹1中M9向M8切换，PCOS早期M9活性较高、晚期M8更突出；轨迹2呈M9早期激活后M1、M5、M7、M3中间激活及M10、M2晚期激活的阶段序列。
基于SCENIC的调控子活性分析 delineates PCOS相关转录调控特征（SCENIC-Based Regulon Activity Profiling Delineates PCOS-Associated Transcriptional Regulatory Features）：鉴定376个调控子及15,083个候选靶基因；调控子活性嵌入较RNA表达嵌入更好区分PCOS与对照，调控子定义簇与GC亚群对应，GC3具有最多表型特异性调控子（n=10）。
PCOS相关GC3亚群中Rora调控子异常激活（Aberrant Rora Regulon Activation in the PCOS-Associated GC3 Subpopulation）：GC3中Rora和Runx2调控子在PCOS中激活，GC2中Zbtb12激活；hdWGCNA M8模块枢纽基因、GC3标志基因及GC3表型特异性转录因子交集汇聚于Rora；Rora调控子活性在PCOS升高，Rora RNA表达呈一致趋势；Rora–regulon–active GCs主要位于GC3较早拟时序而非终末成熟端，提示不完全分化，并富集脂质合成、脂质分解、脂质定位调节及甘油三酯生物合成正调控；该亚群在PCOS GC3中占51.3%，对照仅2.61%，并在人GSE240688与GSE98595数据中支持PCOS富集。
Rora虚拟敲低重塑颗粒细胞发育流场并扰动疾病相关基因网络（Rora Virtual Knockdown Reshaped the Granulosa Cell Developmental Flow Field and Perturbed a Disease-Relevant Gene Network）：CellOracle显示Rora在GC3高表达、沿拟时序升高且PCOS较高；虚拟敲低后发育向量场局部重塑，GC3部分向GC4转向，GC4部分由轨迹1转向轨迹2，GC1向GC0转向，GC0受影响较小；scTenifoldKnk鉴定135个显著扰动基因（P_adj < 0.05），包括Wfdc10、Cyp11a1和Fdx1，富集于代谢与内分泌调控、程序性细胞死亡正调控、脂质代谢、前列腺素合成及FSH调控凋亡等过程。
涉及Rora–regulon–active GC亚群的PCOS相关细胞–细胞通讯改变（PCOS-Associated Alterations in Cell–Cell Communication Involving the Rora–Regulon–Active GC Subset）：CellChat显示PCOS中GC3、上皮细胞和巨噬细胞总体互作增强；Rora–regulon–active GCs接收信号主要来自基质和上皮细胞，发出信号主要指向巨噬细胞；MK信号通路在基质细胞中活性较高，Mdk–Ncl与Mdk–Sdc1配体–受体对贡献显著，Mdk主要表达于基质细胞，Sdc1在Rora–regulon–active GCs中相对特异高表达；NicheNet提示12个关键配体包括Mfge8、Clu、Vegfa和Itgb1，Vegfa对巨噬细胞靶基因Rilpl2调控潜力最突出，Timp3和Spp1主要指向Tnf。
靶向Rora–regulon–active GC亚群的潜在候选药物（Potential Candidate Drugs Targeting the Rora–Regulon–Active GC Subset）：drug2cell分析得到19个共识候选药物，其中7个在Rora–regulon–active GCs中兼具较高平均药物活性评分和较高阳性细胞比例；hCG、r-hCG、hMG、r-hLH和LH为既有排卵诱导药物，作为流程内部验证；盐酸甜菜碱（betaine hydrochloride）和贝派地酸（bempedoic acid）为不在标准PCOS方案中的潜在新候选。
讨论部分总结：该研究指出PCOS相关GC异常更突出地表现为阶段特异性细胞状态重分布及转录调控程序改变，而非单纯稳态基因表达变化；Rora（人同源基因RORA）位于15q22.2，属核受体超家族，既往证据涉及脂质代谢、糖稳态、昼夜节律及类固醇生成，并受雄激素受体与雌激素受体α等调控，且可调控CYP19A1、HSD17B10等类固醇生成基因。Rora–regulon–active GCs的不完全黄体化及脂质代谢程序激活，可能破坏正常黄体化相关功能并影响卵泡成熟；Mdk–Sdc1轴和Vegfa–Rilpl2等通讯线索为卵巢微环境机制提供候选方向；betaine hydrochloride与bempedoic acid的代谢、抗炎及调脂特性为其作为PCOS候选药物提供理论线索。局限包括以小鼠数据为主、人数据仅作探索性支持、GSE98595样本量小、批次与供体混杂未系统评估、同一生物样本细胞非独立重复、虚拟扰动缺乏体内外因果验证、候选药物尚未证明疗效与安全性。
研究结论翻译：总之，研究人员在小鼠卵巢中鉴定出PCOS富集的一类黄体化壁层GC亚群，其特征为Rora调控子异常激活，称为Rora–regulon–active GCs。该亚群显示与不完全黄体化及增强的脂质代谢相关程序一致的转录特征。细胞–细胞通讯分析推断Rora–regulon–active GCs与卵巢微环境中基质细胞和巨噬细胞之间存在潜在相互作用。计算机模拟药物重定位优先提出盐酸甜菜碱（betaine hydrochloride）和贝派地酸（bempedoic acid）作为待实验评估的候选化合物。综上，这些发现为PCOS中GC功能障碍提供细胞状态视角，并将Rora确定为GC分化的候选调控因子以供进一步功能研究。