疫苗接种与混合免疫暴露后两年SARS-CoV-2免疫记忆轨迹：T细胞功能质量与S1特异性IgG差异比较

《Clinical Immunology Communications》：Comparative Analysis of SARS-CoV-2 Immune Memory in Vaccinated and Hybrid individuals Two Years Post-Exposure

　　

评估疫苗有效性及持久性可通过检测疫苗诱导的血清抗体以及接种后数年循环血中的记忆B细胞和T细胞来实现，这些指标可作为保护性和耐久性的指示。研究人员在既往研究基础上，评估SARS-CoV-2刺突（spike, S）蛋白特异性免疫球蛋白的血清水平，以及接种个体和混合免疫（hybrid immunity）个体中S蛋白特异性免疫记忆状态。研究旨在确定文献中报告的接种后至多6个月的免疫记忆模式在疫苗暴露两年后是否仍然存在。疫苗接种和混合免疫均诱导持久且稳健的抗原特异性T细胞和B细胞应答，记忆亚群在暴露后长达两年仍可检测。混合免疫个体显示中央记忆、效应记忆和效应T细胞亚群更大扩增，并在抗原刺激后每个细胞产生更多干扰素γ（interferon-gamma, IFN-γ），表明效应细胞功能质量更优。B细胞分析显示，混合免疫个体具有更高频率的S特异性B细胞，这些细胞在扩增后更快分化为浆母细胞（plasmablasts）和浆细胞（plasma cells），导致这些亚群数量增加。相反，接种个体在培养上清和血清中均表现出更高的S1特异性IgG水平。鉴于独立供者数量有限，这些发现对这些人群的长期疫苗免疫和混合免疫应答提供探索性表征。总之，研究结果表明，在暴露约两年后，混合免疫个体维持稳健的细胞免疫应答，而接种个体保留更高的S1特异性IgG抗体应答。

Czdari Lee、Imtisal Imran、Sara Thomas和Mahyar Nouri-Shirazi围绕SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）疫苗接种与混合免疫（hybrid immunity）暴露后约两年的免疫记忆进行比较。研究背景在于，mRNA疫苗编码SARS-CoV-2刺突（spike, S）糖蛋白，记忆B细胞（memory B cells）、记忆T细胞（memory T cells）与抗体应答共同构成疫苗诱导适应性免疫的基础；CD4⁺ T辅助细胞协调CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞和B细胞分化，CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞清除病毒感染细胞，抗体中和细胞外病原体，短寿命浆母细胞（plasmablasts）和长寿命浆细胞（plasma cells）及记忆B/T细胞维持保护与回忆应答。既往研究报道接种后6个月时，混合免疫者S特异性IgG记忆B细胞频率和抗体滴度较高，而循环S特异性CD8和CD4 T细胞差异较温和。由此产生的问题是：文献中至多6个月的免疫记忆模式在疫苗暴露两年后是否仍存在。研究人员因此比较无额外自然感染或加强接种前，接种（vaccinated, V）个体与感染/接种（infected/vaccinated, I/V）混合免疫个体暴露后约两年的S特异性记忆T、B细胞和血清抗体，以探索长期免疫记忆轨迹及其意义。

关键技术方法：样本来自Florida Atlantic University临床研究单元（Clinical Research Unit）健康成人队列：未接种（unvaccinated, UV）3例、接种（V）3例、感染/接种（I/V）5例，2023年采血分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）；以CFSE标记和S疫苗抗原体外刺激8天评估T细胞回忆反应，以R848与IL-2多克隆刺激14天评估B细胞分化，结合流式细胞术（flow cytometry）、胞内IFN-γ染色及酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测S1特异性IgG，采用ANOVA或Kruskal–Wallis检验。

结果部分：3.1 CD4记忆反应：通过S抗原刺激PBMC 6天和8天后流式检测，接种和混合免疫个体的中央记忆（central memory, T_CM）、效应记忆（effector memory, T_EM）和效应T细胞（effector T cells, T_E）CD4⁺亚群数量高于未接种者；第6天合计亚群分别高25倍和29倍，混合免疫对未接种比较有统计学显著性；第8天分别高17倍和18倍，混合免疫对未接种比较仍有显著性；效应记忆与效应CD4⁺ T细胞第6天分别高29倍和37倍、第8天高36倍和51倍，混合免疫对未接种两日均显著；混合免疫数值高于接种者1.3倍和1.4倍，但无统计学显著性。3.2 CD8记忆反应：通过同样S抗原刺激和流式检测，接种和混合免疫者中央记忆、效应记忆和效应CD8⁺ T细胞数量高于未接种者；合计亚群第6天分别高16倍和50倍、第8天高14倍和17倍，均无统计学显著性；效应记忆与效应CD8⁺ T细胞第6天分别高13倍和36倍、第8天高16倍和22倍，仅混合免疫对未接种第6天比较显著；混合免疫对接种者第6天和第8天分别高2.8倍和1.3倍，但无统计学显著性。3.3 IFN-γ产生效应细胞频率与质量：通过胞内染色和上清ELISA检测，总IFN-γ表达T细胞接种者较未接种高6.9倍、混合免疫高1.5倍，混合免疫较接种者少4.5倍，均无统计学显著性；上清IFN-γ总量接种者较未接种高61倍、混合免疫高99倍，混合免疫对未接种比较显著；混合免疫较接种者高1.6倍但无显著性；按上清浓度与IFN-γ产生T细胞频率计算，混合免疫效应T细胞每细胞分泌IFN-γ为2.4 pg/cell，接种者为0.32 pg/cell，差异无统计学显著性。3.4 S特异性记忆B细胞：通过未刺激或R848与IL-2刺激5天后CD19、生物素化S蛋白和荧光链霉亲和素染色流式检测，未刺激第5天S特异性B细胞接种者较未接种高3.3倍、混合免疫高6.9倍；刺激后接种者高3.9倍、混合免疫高2.3倍；刺激使接种者和混合免疫者分别数值增加13倍和3.8倍；各组间无统计学显著差异。3.5 浆母细胞、浆细胞频率与IgG产生：通过R848与IL-2刺激14天流式检测B细胞亚群和ELISA检测上清S1特异性IgG，类别转换记忆B细胞接种者较未接种高1.1倍、混合免疫高2.0倍，无显著性；浆母细胞接种者高2.0倍、混合免疫高4.0倍，仅混合免疫对未接种显著；浆细胞接种者减少1.1倍、混合免疫增加2.8倍，混合免疫对未接种和接种者均显著；合并浆母细胞与浆细胞时接种者高1.4倍、混合免疫高3.0倍，混合免疫较接种者高2.1倍但无显著性；培养上清S1特异性IgG在未接种者未检出，接种者为422 ng/mL、混合免疫者为64 ng/mL，接种者对未接种显著，接种者对混合免疫6.6倍数值差异无显著性；每细胞S1特异性IgG第14天接种者为0.01 ng、混合免疫者为0.001 ng。3.6 血清S特异性IgG：通过ELISA检测血清总IgG和S蛋白特异性IgG，总IgG在所有血清中检出，S特异性IgG在未接种者缺失；S特异性IgG接种者约28 μg/mL、混合免疫者约20 μg/mL，仅接种者对未接种比较显著；混合免疫者血清总IgG较接种者高1.4倍。

讨论部分总结：讨论指出mRNA疫苗编码全长预融合稳定S蛋白，包含S1和S2亚基，S1含受体结合域和N端域，S2介导膜融合；自然感染者还暴露核衣壳蛋白。接种和混合免疫者经体外抗原刺激均显著扩增中央记忆、效应记忆和效应CD4⁺及CD8⁺ T细胞亚群；混合免疫者效应T细胞亚群增加幅度更高但多未达统计学显著。细胞因子分析显示接种者总IFN-γ表达T细胞绝对数较高，而混合免疫者T细胞每细胞产生更多IFN-γ，提示其S特异性记忆T细胞再暴露后转化为功能增强的效应细胞。B细胞分析显示暴露约两年后自然感染与总记忆B细胞更广泛扩增相关，混合免疫培养来源浆细胞分泌较低S1特异性IgG；由于研究仅检测S1特异性IgG而未直接测S2或核衣壳特异性B细胞和抗体应答，额外记忆B细胞群的抗原特异性不能由数据确定。限制包括样本量小使多数接种者与混合免疫者比较统计效能有限，结果应视为探索性和假设生成性；S蛋白⁺ B细胞门控依赖未染色阴性对照且因培养后细胞有限未能纳入FMO对照；各亚群绝对数为培养回收活细胞总数乘以流式亚群频率的估算值。研究结论（翻译）：总之，研究结果显示，疫苗接种和混合免疫均诱导稳健的抗原特异性T细胞和B细胞应答，暴露后长达两年仍可检测到功能性记忆应答。单独疫苗接种仍高度有效，而疫苗接种前或后发生感染可能对长期免疫记忆和持久性提供额外益处。