《Journal of Virology》：Antagonism of PRDX1 and Japanese encephalitis virus via the autophagy pathway
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日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种蚊媒人畜共患传染病病原体，可引起动物和人类中枢神经系统疾病。日本脑炎病毒造成严重危害，即使已有获批疫苗，其预防和控制仍面临巨大挑战，病毒与宿主相互作用的分子机制尚未完全阐明。本
日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种蚊媒人畜共患传染病病原体，可引起动物和人类中枢神经系统疾病。日本脑炎病毒造成严重危害，即使已有获批疫苗，其预防和控制仍面临巨大挑战，病毒与宿主相互作用的分子机制尚未完全阐明。本研究发现宿主过氧化物氧还蛋白1（peroxiredoxin 1，PRDX1）可抑制JEV复制。PRDX1靶向JEV非结构蛋白1（nonstructural protein 1，NS1），并通过蛋白酶体和自噬途径介导其降解，从而抑制病毒复制。通过靶向E3连接酶TRAF6，PRDX1催化NS1的泛素化，使其被货物受体NDP52识别，并伴随溶酶体降解。研究还发现，JEV NS3蛋白可靶向并降解PRDX1，以降低PRDX1的抗病毒功能，这是病毒对抗宿主的一种策略。总之，这些发现表明选择性自噬在宿主与JEV之间具有双重功能：它既能降解病毒蛋白以抑制病毒复制，也能降解宿主抗病毒蛋白以促进病毒复制。
一、研究背景与科学问题
日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种蚊媒传播的黄病毒（flavivirus），是全球病毒性脑炎的主要病原体之一。JEV感染可导致人类严重脑炎，并引起妊娠母猪流产、仔猪发育不良或木乃伊胎等繁殖障碍。猪是JEV的主要扩增宿主，在病毒流行病学传播中发挥关键作用。随着全球变暖和人口流动加剧，RNA病毒感染的威胁日益增加。尽管已有获批疫苗，但疫苗效力有限、缺乏获批的抗病毒治疗药物以及蚊媒传播的复杂性使JEV的防控仍面临严峻挑战，因此深入理解病毒与宿主相互作用的分子机制对于改进防控策略至关重要。
JEV基因组为长约11 kb的单股正链RNA，编码三种结构蛋白（C、M、E）和七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。其中NS1是JEV复制中不可或缺的多功能蛋白，参与负义和正义病毒RNA的合成及内质网相关复制复合体的形成。NS1在黄病毒中高度保守，具有糖基化位点，对免疫调节、免疫逃逸、病毒增殖和感染性病毒颗粒释放具有关键影响。因此，阐明NS1调控病毒复制的机制对控制JEV感染至关重要。
过氧化物氧还蛋白（Peroxiredoxins，PRDXs）是一类抗氧化蛋白，通过将过氧化氢转化为水来维持氧化还原稳态。其中PRDX1是一种23 kDa的应激诱导型巨噬细胞氧化还原蛋白，具有分子伴侣、转录调控等多种功能。PRDX1在不同病毒感染中发挥不同作用：一方面，PRDX1通过与TBK1/IKKε相互作用负调控伪狂犬病病毒的增殖；另一方面，PRDX1与流感病毒核糖核蛋白相互作用并为高效复制所必需。然而，PRDX1在JEV复制中的功能此前尚不清楚。
自噬（autophagy）是 eukaryotic 细胞中通过溶酶体降解细胞内容物的过程，分为非选择性和选择性两类。选择性自噬通过货物受体识别高度多聚泛素化的底物，并将底物递送至自噬机器。自噬在病毒-宿主相互作用中发挥多种作用：既可促进病毒增殖，也可通过降解入侵微生物和启动固有免疫来限制病原体。已有研究表明雷帕霉素诱导的自噬促进JEV增殖，而自噬抑制则降低JEV增殖，提示自噬在JEV增殖中具有正向调控作用。然而，自噬在JEV感染中的双重功能及其分子机制仍需深入探究。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱和肽段测序，筛选与JEV NS1蛋白相互作用的宿主蛋白，鉴定出宿主因子PRDX1。研究发现PRDX1通过靶向并降解JEV NS1蛋白来抑制病毒复制，其机制涉及蛋白酶体途径和TRAF6-NDP52自噬途径。具体而言，PRDX1通过靶向E3连接酶TRAF6催化NS1的泛素化，使泛素化的NS1被货物受体NDP52识别，进而通过自噬溶酶体途径降解。与此同时，研究人员发现JEV感染可下调细胞内PRDX1蛋白水平，且该过程由病毒NS3蛋白介导。NS3蛋白通过自噬途径降解PRDX1，降低宿主的抗病毒功能，从而促进病毒复制。该研究揭示了选择性自噬在宿主与JEV之间的双重功能：既能降解病毒蛋白以抑制病毒复制，也能降解宿主抗病毒蛋白以促进病毒复制，为理解黄病毒生命周期中自噬的作用提供了新见解。
三、主要技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱（mass spectrometry）和肽段测序筛选与JEV NS1相互作用的宿主蛋白；通过GST pull-down实验验证蛋白间的直接相互作用；使用激光共聚焦免疫荧光实验观察蛋白在细胞内的共定位；通过Western blot检测蛋白表达水平变化；采用qRT-PCR和TCID50实验评估病毒复制水平；利用RNA干扰（siRNA）技术敲低目标基因表达以验证其功能；使用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂（CQ、3-MA、BafA1）区分蛋白降解途径。细胞实验主要使用PK15、BHK-21、HEK 293T和HeLa细胞系，JEV毒株保存于中国农科院上海兽医研究所。
四、研究结果
PRDX1抑制JEV复制：通过Co-IP和质谱筛选鉴定出PRDX1与JEV NS1相互作用。在PK15和BHK-21细胞中过表达PRDX1后，Western blot、qRT-PCR和TCID50实验均显示JEV复制受到抑制，且抑制效果呈剂量依赖性。相反，敲低PRDX1后JEV复制增强，表明宿主因子PRDX1阻碍JEV复制。
PRDX1靶向并介导JEV NS1蛋白降解：Co-IP和GST pull-down实验证实PRDX1与JEV NS1直接结合，共聚焦实验显示两者在细胞质中共定位。PRDX1过表达使NS1蛋白水平呈剂量依赖性下降。MG132和自噬抑制剂（CQ、3-MA、BafA1）处理可阻断PRDX1诱导的NS1降解，且PRDX1过表达显著促进NS1的泛素化，表明PRDX1通过蛋白酶体和自噬途径介导NS1降解。
PRDX1与TRAF6和NDP52相互作用：Co-IP和GST pull-down实验证实PRDX1与TRAF6和NDP52直接相互作用，且不依赖RNA。共聚焦实验显示PRDX1与TRAF6、NDP52在细胞质中共定位，提示TRAF6连接酶和NDP52受体参与PRDX1介导的NS1降解。
JEV NS1蛋白通过PRDX1-TRAF6-NDP52-自噬体途径被降解：Co-IP、GST pull-down和共聚焦实验证实NS1与TRAF6和NDP52相互作用。敲低TRAF6或NDP52可阻断PRDX1介导的NS1降解，且在PK15细胞中干扰TRAF6后病毒复制能力恢复，表明PRDX1通过TRAF6-NDP52-自噬体途径促进JEV NS1降解。
JEV NS3蛋白在病毒感染期间降低PRDX1蛋白丰度：JEV感染PK15细胞后PRDX1蛋白水平显著下降，而PRDX1 mRNA水平升高，且蛋白下降程度随感染MOI增加而加剧。在HEK 293T细胞中过表达JEV各病毒蛋白，发现NS3蛋白过表达可下调PRDX1蛋白水平，且呈剂量依赖性。
JEV NS3通过自噬途径降解PRDX1蛋白：自噬抑制剂可阻断NS3介导的PRDX1降解。Co-IP和GST pull-down实验证实NS3与PRDX1直接相互作用，且NS3还与TRAF6和NDP52相互作用。共聚焦实验显示NS3与PRDX1、TRAF6、NDP52在细胞中共定位，表明NS3通过TRAF6-NDP52自噬途径降解PRDX1以抑制其抗病毒功能。
五、讨论与结论
本研究揭示了宿主因子PRDX1拮抗JEV感染的新功能。PRDX1通过蛋白酶体和TRAF6-NDP52-自噬体途径诱导JEV NS1蛋白降解，从而拮抗病毒增殖。同时，JEV感染下调PRDX1蛋白水平，病毒通过NS3蛋白借助宿主自噬途径介导PRDX1蛋白降解。研究还发现宿主细胞通过增加PRDX1 mRNA水平来抑制病毒感染，但JEV通过降低PRDX1蛋白水平来削弱宿主细胞的抗病毒功能。
该研究阐明了PRDX1介导的抗病毒机制在JEV感染中的新作用，揭示了自噬在JEV复制中的双重功能：自噬既能降解病毒蛋白以抑制病毒复制，也能降解宿主抗病毒蛋白以促进病毒复制。这些发现深化了对黄病毒生命周期中自噬作用的理解，为JEV防控策略的优化提供了新的分子靶点和理论依据。
