《Journal of Virology》：No-known-vector flaviviruses exhibit diverse replication and virulence phenotypes in mice
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摘要：正黄病毒属（Orthoflavivirus genus；黄病毒，flaviviruses）包括具有全球意义的虫媒病毒（arboviruses），其在节肢动物媒介（蚊和蜱）与脊椎动物宿主之间循环。相比之下，无已知媒介黄病毒（no-known-vector
摘要：正黄病毒属（Orthoflavivirus genus；黄病毒，flaviviruses）包括具有全球意义的虫媒病毒（arboviruses），其在节肢动物媒介（蚊和蜱）与脊椎动物宿主之间循环。相比之下，无已知媒介黄病毒（no-known-vector flaviviruses, NKVFVs）已从啮齿动物和蝙蝠中分离，但尚未从节肢动物中分离，因此被认为通过非媒介依赖途径传播。然而，对这些病毒的宿主范围和致病机制知之甚少。为评估NKVFV致病性，研究人员通过足垫接种感染野生型、Ifnar1?/?和Ifnar1?/? Ifngr1?/?小鼠，所用病毒为12种NKVFVs：ENTV（Entebbe bat virus）、SOKV（Sokuluk virus）、YOKV（Yokose virus）、MODV（Modoc virus）、APOIV（Apoi virus）、JUTV（Jutiapa virus）、SVV（Sal Vieja virus）、DBV（Dakar bat virus）、RBV（Rio Bravo virus）、MMLV（Montana myotis leukoencephalitis virus）、PPBV（Phnom Penh bat virus）和TABV（Tamana bat virus）。研究人员将这些NKVFVs与蚊媒寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）和凯杜古病毒（Kedougou virus, KEDV）以及蜱媒兰加特病毒（Langat virus, LGTV）和卡达姆病毒（Kadam virus, KADV）进行比较。研究人员监测疾病体征并测定病毒血症（viremia）。七种NKVFVs（ENTV、SOKV、YOKV、MODV、APOIV、DBV、RBV）在Ifnar1?/?小鼠中具有毒力，感染后9天内引起100%致死，并伴随病毒血症。所有测试病毒在Ifnar1?/? Ifngr1?/?小鼠中均具有毒力，且与Ifnar1?/?小鼠相比产生更高病毒血症。在野生型小鼠中未检测到病毒血症或疾病体征。研究人员进一步评估了RBV、MMLV和PPBV在小鼠原代成纤维细胞（primary fibroblasts）和骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）中，以及在来自三种蝙蝠物种的细胞系中的复制。总之，研究结果提供了关于NKVFVs毒力和复制表型的新信息，支持未来研究NKVFV特异性和泛黄病毒（pan-flavivirus）致病机制。重要性：引起人类疾病的黄病毒由蚊和蜱传播（例如西尼罗病毒（West Nile virus）、黄热病毒（yellow fever virus）、蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus））。但存在相关黄病毒不已知感染节肢动物，因此被认为通过非媒介依赖途径传播（无已知媒介黄病毒，NKVFVs）。对NKVFVs了解不多，但其为更广泛理解黄病毒复制、嗜性（tropism）和致病机制提供了机会。研究人员评估了12种NKVFVs在具有和不具有抗病毒干扰素（interferon, IFN）应答的小鼠中致病能力，以及其在小鼠细胞中的复制。研究人员的发现提供了关于这些研究不足病毒的新信息，并证明哪些小鼠模型可能适合用于NKVFVs的进一步研究。
正黄病毒属（Orthoflavivirus genus；黄病毒，flaviviruses）包括西尼罗病毒、登革病毒（dengue virus）、黄热病毒和蜱传脑炎病毒等全球重要虫媒病毒（arboviruses），其在节肢动物媒介与脊椎动物宿主之间循环的需求构成其生态学、流行病学和进化的基础。已知人类病原黄病毒由蚊或蜱传播，即蚊媒黄病毒（mosquito-borne flaviviruses, MBFV）和蜱媒黄病毒（tick-borne flaviviruses, TBFV）。正黄病毒属还包括在蚊中垂直传播但不感染脊椎动物的昆虫特异性黄病毒（insect-specific flaviviruses, ISFV），以及在脊椎动物中发现但无已知节肢动物媒介的无已知媒介黄病毒（no-known-vector flaviviruses, NKVFVs）。总体而言，黄病毒传播机制反映在其系统发育中，MBFV、TBFV、ISFV和NKVFV形成若干不同遗传群组，但媒介和宿主嗜性并非单系。NKVFVs见于三个不同分支：一个位于MBFV群内，一个邻近TBFVs，一个形成独立属。上述遗传群组之间的关系及趋势例外提示，在黄病毒进化过程中存在多次宿主范围与传播机制扩张或限制，可能促成新人类或动物病原体出现。理解控制黄病毒媒介和宿主嗜性及其决定传播机制的机制，对于评估未来新发病毒风险很重要；理解具有多样宿主范围和传播机制的黄病毒的組織与物种嗜性及病毒-宿主互作，可为已感染人类、家畜和野生动物的黄病毒的复制和致病机制提供洞见。NKVFVs已从全球啮齿动物和蝙蝠中分离，但其生态学、细胞生物学和致病机制知之甚少。NKVFV致病性已在多种模型中评估，包括小鼠、仓鼠、非人灵长类、鸡胚、兔和蝙蝠；但既往研究评估的NKVFV集有限，且一般未采用支持宿主应答控制病毒嗜性和致病机制机制研究的现代转基因小鼠品系。研究人员旨在用常用小鼠模型评估一大组NKVFVs（已报道17种中的12种），以界定这些病毒的致病特征并识别可支持未来新发或暴发情境研究的小鼠模型。研究人员使用野生型C57BL/6小鼠、缺乏I型干扰素（IFN-αβ）信号的小鼠（Ifnar1
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?/?）以及这些小鼠来源的原代细胞；并进一步评估蝙蝠来源NKVFVs在蝙蝠细胞系中的复制，以更好模拟其与蝙蝠宿主的互作。总之，该工作首次在多种小鼠模型中对多样NKVFVs进行综合比较，扩展了对这些病毒的理解，并为广泛研究黄病毒致病机制提供系统。结果部分：正黄病毒全基因组序列及系统发育比较：为确认实验室病毒库序列，研究人员对Aedes flavivirus、Apoi virus、Aroa virus、Banzi virus、Culex flavivirus、Dakar bat virus、Iguape virus、Jutiapa virus、Kedougou virus、Modoc virus、Phnom Penh bat virus、Rio Bravo virus、Sal Vieja virus、Sokuluk virus、Tamana bat virus、Usutu virus和Yokose virus的病毒库进行深度测序，生成完整编码序列。虽然多数病毒此前已有完整编码序列，但Sal Vieja virus此前可用序列仅包含部分NS5编码序列；研究人员还为Dakar bat virus株AD D249生成了完整M和E编码序列，该序列此前不可用。基于完整编码序列构建正黄病毒系统发育树，其拓扑包括NKVFVs分为三个不同分支，与既往工作一致。无已知媒介黄病毒感染在小鼠中引起不同程度的致死性和病毒血症：为评估NKVFV在小鼠中的毒力，研究人员以1,000病灶形成单位（focus-forming units, FFU）经足垫皮下接种5至6周龄野生型C57BL/6、Ifnar1
?/?和Ifnar1
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?/?小鼠，接种12种NKVFVs，并评估21天致死性；同时以蚊媒ZIKV、KEDV和蜱媒KADV、LGTV比较。ZIKV和LGTV在Ifnar1
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?/?小鼠中引起100%致死，在野生型小鼠中无致死，与既往研究一致；KEDV和KADV表现相似毒力。测试的NKVFVs均未在野生型小鼠中引起致死，这对原本从啮齿动物分离的NKVFVs（如APOIV、MODV）尤其值得注意。在Ifnar1
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?/?小鼠中观察到不同程度致死性：ENTV、SOKV、YOKV、APOIV、MODV、DBV和RBV均在Ifnar1
?/?小鼠中引起100%致死，而SVV、PPBV和TABV各自引起<25%致死；JUTV和MMLV在Ifnar1
?/?小鼠中不引起致死。在Ifnar1
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?/?小鼠中测试的所有病毒（ZIKV、KADV、LGTV、JUTV、SVV、RBV、MMLV、PPBV和TABV）均引起>95%致死。部分在Ifnar1
?/?小鼠中引起100%致死的病毒未在Ifnar1
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?/?小鼠中评估。结果表明IFN-αβ信号是限制NKVFV小鼠毒力的关键宿主反应，IFN-γ信号提供额外控制，与许多媒介传播黄病毒（包括ZIKV等）的发现一致。为确定NKVFV能否在小鼠中复制并产生病毒血症，研究人员在感染后2、4和6天经颌下采血收集同一批致死性研究小鼠的连续血清样本，并用病灶形成试验（focus-forming assay, FFA）测定感染性病毒滴度。在任何测试病毒感染的野生型小鼠血清中未检测到感染性病毒。在Ifnar1
?/?小鼠中，病毒血症随时间呈四种不同趋势：病毒血症在2 dpi达峰后下降（ZIKV、ENTV、SOKV、YOKV、MODV、SVV和TABV）；所有采集时间点病毒血症恒定（JUTV、KADV和RBV）；所有采集时间点病毒血症上升（APOIV、DBV和LGTV）；未检测到病毒血症（MMLV和PPBV）。总体而言，Ifnar1
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?/?小鼠中病毒血症的幅度和持续时间大于Ifnar1
?/?小鼠，并呈现同样四种趋势；在Ifnar1
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?/?小鼠中，一些病毒引起快速致死，妨碍对完整6天病毒血症趋势的评估。总体而言，病毒血症与毒力关系不一致；例如Ifnar1
?/?小鼠对APOIV快速死亡，但2 dpi病毒血症并不高于某些致死较慢的病毒（YOKV、TABV）；MODV在Ifnar1
?/?小鼠中于6至8 dpi引起100%致死，但2和4 dpi病毒血症低于其他病毒；MMLV或PPBV感染的Ifnar1
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?/?小鼠虽95%–100%致死，FFA未检出病毒血症。为提高病毒血症检测敏感性，研究人员用反转录定量PCR（RT-qPCR）分析RBV、MMLV和PPBV感染的Ifnar1
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?/?小鼠血清，在所有时间点检测到病毒血症。总体表明NKVFV可在易感小鼠中产生病毒血症，但病毒血症不直接对应毒力。蝙蝠来源NKVFVs在原代小鼠细胞中具有不同复制动力学：MMLV、PPBV和RBV为系统发育聚类在一起的蝙蝠来源NKVFVs；然而MMLV和PPBV在Ifnar1
?/?小鼠中不引起致死，而RBV引起100%致死，RBV也产生更高病毒血症。为评估这三种病毒在小鼠细胞中的复制，研究人员从野生型、Ifnar1
?/?和Ifnar1
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?/?小鼠制备小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）并进行多步生长曲线；以感染复数（multiplicity of infection, MOI）0.01感染RBV、MMLV或PPBV，在感染后4、24、48和72小时收集上清，Vero细胞作为感染阳性对照。RBV能在所有测试细胞类型中复制，在Ifnar1
?/?和Ifnar1
?/? Ifngr1
?/? MEFs中复制高于Vero细胞，在野生型MEF中较低；MMLV和PPBV复制较RBV大幅减弱，MMLV在Ifnar1
?/?和Ifnar1
?/? Ifngr1
?/? MEFs中复制但不在野生型MEF中复制，PPBV在任何MEF系中几乎检测不到。由于黄病毒通常靶向髓系细胞而非成纤维细胞，研究人员评估RBV、MMLV和PPBV在野生型、Ifnar1
?/?和Ifnar1
?/? Ifngr1
?/?小鼠来源BMDMs中的复制；BMDMs和Vero细胞以MOI 0.01感染，4、24、48和72 hpi收集上清。BMDMs中总体复制趋势与MEFs相似：RBV在Ifnar1
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?/? BMDMs中复制至高滴度，MMLV仅复制至低滴度，PPBV感染BMDMs中未检测到感染性病毒。与MEFs中RBV和MMLV在Ifnar1
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?/?细胞中复制高于Ifnar1
?/?不同，BMDMs中RBV或MMLV在Ifnar1
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?/?与Ifnar1
?/?间无显著差异。总体表明IFN-αβ信号在限制RBV和MMLV小鼠细胞复制中起关键作用；值得注意的是，PPBV在Ifnar1
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?/? MEFs或BMDMs中未检测到复制，尽管PPBV在Ifnar1
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?/?小鼠中引起100%致死，提示其他细胞类型可能是PPBV感染的关键靶点。蝙蝠来源NKVFVs在蝙蝠组织来源细胞系中具有不同复制动力学：RBV、MMLV和PPBV已从野生蝙蝠分离：RBV来自Tadarida brasiliensis唾液腺，MMLV来自Myotis lucifugus唾液腺，PPBV来自Cynopterus brachyotis唾液腺和棕色脂肪。为评估RBV、MMLV和PPBV在蝙蝠来源细胞系中的复制能力，研究人员以MOI 0.01感染Tb1Lu（Tadarida brasiliensis肺上皮细胞）、Efk3B（Eptesicus fuscus肾上皮细胞）和LaBo（Lasiurus borealis）细胞系，并在4、24、48和72 hpi收集上清。RBV在LaBo细胞中复制至高滴度，等同于Vero细胞中的复制，在Efk3B和Tb1Lu细胞中滴度较低。MMLV在Efk3B和Tb1Lu细胞中的复制与BMDMs和MEFs中相似，缓慢且首次在48 hpi检测到，72 hpi增加；但在Efk3B细胞中MMLV复制于48 hpi达峰后开始下降。在Tb1Lu或LaBo细胞中未检测到PPBV复制，与BMDMs和MEFs中缺乏PPBV复制一致；但PPBV在Efk3B细胞中确实表现出低水平复制，这是PPBV在干扰素应答 competent 细胞系中复制的首个例子。讨论部分总结：正黄病毒可按节肢动物媒介在传播中的作用分为四组：蚊媒、蜱媒、昆虫特异性或无已知媒介黄病毒；遗传相关通常对应共同传播机制，但这些分组并非单系。NKVFVs已从全球蝙蝠和啮齿动物分离；蝙蝠来源NKVFVs已从美国、墨西哥、特立尼达、乌干达、马达加斯加、吉尔吉斯斯坦、柬埔寨、马来西亚和日本分离，宿主包括食虫蝙蝠和食果蝙蝠；啮齿来源NKVFVs已从美国、加拿大、危地马拉和日本分离。近期通过宏基因组方法或经典分离从水生脊椎动物和无脊椎动物中鉴定出更多正黄病毒及Flaviviridae科相关未分类成员，突出黄病毒宿主范围广泛。许多重要人类病原体属于蚊媒或蜱媒黄病毒；三种NKVFVs曾报告引起人类疾病：Rio Bravo virus、Apoi virus和Modoc virus；RBV引起一次自然感染和七次实验室获得性感染，表现从发热到中枢神经系统受累；APOIV一次实验室获得性感染导致发热性疾病、脑炎和双侧腿麻痹；MODV与一名接触病鼠儿童的的无菌性脑膜炎相关。本研究聚焦三种蝙蝠来源NKVFVs：MMLV、RBV和PPBV；这些病毒地理分布不同，RBV和MMLV从美国蝙蝠分离，PPBV从柬埔寨分离；蝙蝠是新兴病毒储库宿主，但蝙蝠来源黄病毒相较蝙蝠冠状病毒、副黏病毒和丝状病毒关注较少。仅少数NKVFVs在致病研究中调查，且各研究使用不同动物模型：叙利亚仓鼠（MODV）、SCID小鼠（MODV、MMLV）、免疫competent小鼠（MODV、RBV、MMLV、ENTV）、鹿鼠（MODV）、恒河猴（RBV）和Leschenault’s rousette蝙蝠（YOKV）。本研究中研究人员用C57BL/6野生型、Ifnar1
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?/?小鼠、皮下接种途径研究NKVFV致病性，便于与常用这些模型研究的其他黄病毒比较。研究人员试图在NKVFVs中识别病毒学表型模式，比较（i）新世界蝙蝠病毒（MMLV、RBV、TABV）与旧世界蝙蝠病毒（DBV、ENTV、PPBV、SOKV、YOKV）；（ii）蝙蝠来源病毒与啮齿来源病毒（MODV、APOIV、SVV、JUTV）；（iii）食虫蝙蝠病毒与食果蝙蝠病毒（PPBV）；（iv）系统发育分支；（v）乳鼠脑传代数。除ENTV、SOKV和YOKV外，未出现清晰模式；这三种病毒形成系统发育分支、从食虫蝙蝠分离、在Ifnar1
?/?小鼠中表现相似生存和病毒血症结局。值得注意的是，啮齿来源NKVFVs在小鼠中未表现出比蝙蝠来源病毒更强复制或毒力，这可能反映病毒-宿主互作适应特定啮齿宿主物种而非C57BL/6小鼠。本研究病毒分离于1954至1978年，最初经乳鼠脑传代维持，后于Vero细胞扩增；该传代史可能混杂小鼠毒力表型解释，如果乳鼠脑传代选择出对小鼠细胞或神经组织嗜性更强的病毒变异株；但所有病毒均不在野生型小鼠中毒力，部分在Ifnar1
?/?小鼠中无毒力，且报道的鼠脑传代数与病毒学表型无对应，反对既往鼠脑传代对本系统毒力有简单效应；仍需当代分离株和更明确传代史。研究人员评估NKVFV在小鼠来源原代细胞（BMDMs和MEFs）及蝙蝠来源细胞系中的复制，聚焦遗传相关蝙蝠来源病毒RBV、MMLV和PPBV；选择BMDMs和MEFs因其易培养并用于其他黄病毒致病研究。值得注意的是，NKVFV在BMDMs和MEFs中的复制表型不与小鼠毒力表型对应：三种病毒中最毒的RBV在BMDMs和MEFs中复制最强；然而MMLV在Ifnar1
?/?细胞中复制与Ifnar1
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?/?细胞相似，尽管在Ifnar1
?/?小鼠中不致死而在Ifnar1
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?/?小鼠中近100%致死；此外PPBV在BMDMs或MEFs中几乎不复制，却在Ifnar1
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?/?小鼠中引起100%致死，提示其他细胞类型是PPBV（或许还有其他NKVFVs）在Ifnar1
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?/?小鼠中的关键靶点。髓系细胞被认为是蚊媒黄病毒感染人类和小鼠的关键靶点，此细胞嗜性符合这些病毒需建立病毒血症以传播给吸血蚊的需求；NKVFVs可能采用不同的（尚待定义的）传播机制，因此可能表现与媒介传播黄病毒不同的细胞和组织嗜性。研究人员曾预期NKVFV在蝙蝠来源细胞系中的复制与病毒和细胞系的蝙蝠物种来源对应，反映物种特异性病毒-宿主互作，但并非如此：RBV在自然界从大棕蝠和墨西哥无尾蝠分离，但在这些物种来源细胞（Efk3B和Tb1Lu）中的复制低于东红蝠来源LaBo细胞；LaBo细胞支持RBV复制至与Vero细胞相当水平，尽管MMLV和PPBV在LaBo细胞中几乎不复制，提示RBV在这些细胞中强复制有一定特异性；NKVFV复制许可性可能反映细胞系组织来源，Efk3B来源于肾上皮细胞，Tb1Lu来源于肺上皮细胞，LaBo细胞组织来源不明；MMLV在测试细胞系中仅中等复制，但未测试MMLV宿主小棕蝠来源细胞系；据研究人员所知，尚无小棕蝠来源细胞系；真菌感染白鼻综合征使北美小棕蝠种群下降多达90%，其status仍在美国审查中，但因种群急剧下降，不鼓励侵入性采样。PPBV在LaBo或Tb1Lu细胞中无复制，在Efk3B细胞中仅中等复制，但这些细胞系均来自食虫蝙蝠而非PPBV的食果蝙蝠宿主；未来研究NKVFV在更多蝙蝠物种来源细胞、尤其蝙蝠原代细胞中的复制，将为这些病毒嗜性背后的病毒-宿主互作提供更多洞见。本研究使用皮下接种途径，因该途径常用于媒介传播黄病毒研究，但NKVFVs传播途径仍未知；未来可研究不同接种途径如何影响NKVFV感染易感性；同样，病毒载量测量评估病毒血症，这是媒介传播黄病毒感染的关键结局，但病毒血症对非由吸血节肢动物媒介传播的病毒可能不重要；未来可测量可能与其他传播途径更相关的上皮组织病毒载量。这些NKVFVs在小鼠模型中的致病表型为未来研究NKVFV特异性和泛黄病毒致病机制、评估候选疫苗和疗法对黄病毒的作用广度奠定基础，并为应对未来新发黄病毒提供现成实验模型。关键技术方法概括：研究人员对病毒库进行深度测序，生成完整编码序列并基于全多蛋白序列构建系统发育树；使用5至6周龄C57BL/6背景野生型、Ifnar1
?/?和Ifnar1
?/? Ifngr1
?/?小鼠，足垫皮下接种1,000 FFU，21天监测致死性，2、4、6 dpi采血以FFA和RT-qPCR测病毒血症；用小鼠MEFs、BMDMs及蝙蝠细胞系Tb1Lu、Efk3B、LaBo进行MOI 0.01多步生长曲线，4、24、48、72 hpi以FFA滴定。病毒株多来自World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses，ZIKV来自US Centers for Disease Control and Prevention；Efk3B和LaBo细胞系由Dr. Ralph Baric（UNC）提供；小鼠为C57BL/6背景。
