基于CD161免疫评分开发并初步验证的潜伏性结核感染筛查方法：中国训练队列研究

《Microbiology Spectrum》：Development and preliminary validation of a CD161 immunoscore-based screening method for latent tuberculosis infection in a Chinese training cohort

　　

摘要：当前潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection, LTBI）筛查受限于结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test, TST）交叉反应、需复诊要求以及干扰素-γ释放试验（interferon-gamma release assay, IGRA）成本。研究人员开发了一种流式细胞术与深度学习CD161免疫评分筛查方法，并在中国江西两个阶段（N = 269）中对其进行评价。第一阶段（n = 110；92名男性、18名女性）使用健康对照（n = 88）和临床治愈、治疗后结核病（tuberculosis, TB）患者（n = 22）进行模型开发。该治疗后队列作为替代，不等同于未治疗LTBI。第二阶段（n = 159，均为男性）在三个地点提供独立的、概念验证性评价，对照TST，并以IGRA为参考标准。第一阶段最佳模型达到100%敏感性和92%特异性。第二阶段使用非独立验证的、事后Youden选择的截断值（60.57），免疫评分显示81.8%敏感性、80.4%特异性和受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUC）0.833。该性能与TST（90.9%敏感性、72.3%特异性、AUC = 0.816，DeLong P = 0.701）相当。免疫评分特异性显著高于TST（P = 0.049），但敏感性相似（P = 0.521），综合判别改善指数（integrated discrimination improvement, IDI）为0.077（P = 0.021）且校准良好（P = 0.553）。这些探索性、全男性结果不能确立对未治疗LTBI、治疗后致敏或活动性TB的区分能力，需要多样化验证。重要性：基于流式细胞术、由机器学习驱动的CD161免疫评分可提供快速LTBI筛查，诊断性能与既有方法相当。在这项纳入269名参与者的两阶段研究中，独立的159名全男性第二阶段队列显示CD161免疫评分的敏感性为81.8%、特异性为80.4%。在不同学院中LTBI患病率存在七倍差异（1.8%–12.2%）时，性能仍保持一致，支持其稳健性。对于高校等聚集性场所，这种基于实验室的方法可能通过提供同日初始筛查而无需复诊解释结果，带来操作优势。未来可能应用为分阶段路径，即免疫评分阳性个体接受确认性IGRA检测。该实施策略仍属概念性，需对转诊率、实验室能力、可接受性、临床结局和成本效益进行前瞻性评价。这些概念验证发现需在具有足够女性代表性以及更多样化人口学、职业和地理背景的更大外部队列中确认。

研究背景与问题。结核病（tuberculosis, TB）仍是全球感染性疾病主要死亡原因之一，2023年中国报告约741,000例（发病率52/100,000）；世界卫生组织（World Health Organization, WHO）2024年指南指出全球约四分之一人口存在潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection, LTBI，指感染结核分枝杆菌但无活动性临床表现的状态），终身进展风险约5%–10%，中国≥15岁人群LTBI率估计为20.3%。大学等聚集性场所因居住密集、共用空间和密切接触而传播风险较高。现有LTBI筛查缺乏统一金标准；结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test, TST，基于迟发型超敏反应的皮内试验）需48–72 h复诊，且受卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）接种交叉反应影响；干扰素-γ释放试验（interferon-gamma release assay, IGRA，检测结核特异性抗原刺激后IFN-γ释放的免疫学试验）虽更特异，但成本高、需专门实验室和较复杂流程。CD161为C型凝集素样受体，表达于T细胞等，与抗分枝杆菌免疫相关；已有流式细胞术研究提示CD161⁺ T细胞及多参数整合具有潜力。多参数流式数据需机器学习提取信息。基于此，研究人员开发CD161免疫评分（immunoscore，由模型输出的0–100风险评分），并在独立筛查队列中初步评价其识别IGRA阳性能力；研究明确不用于评价LTBI与活动性TB的鉴别。

研究开展与结论意义。研究人员在中国江西开展两阶段研究（N = 269）。第一阶段为混合性别模型开发队列（n = 110；92名男性、18名女性），使用健康对照（n = 88）与临床治愈、治疗后TB患者（n = 22）建立模型；作者明确指出治疗后TB仅作替代，不等同于未治疗LTBI。第二阶段为独立全男性概念验证队列（n = 159），在三个地点以TST为对照、IGRA为参考标准评价。结论显示：第一阶段最佳模型敏感性100%、特异性92%；第二阶段在事后Youden截断值60.57下敏感性81.8%、特异性80.4%、AUC 0.833，与TST（90.9%、72.3%、AUC 0.816）总体相当，特异性显著高于TST而敏感性相似，IDI显著且校准良好；亚组结果较一致。其意义在于提供同日、客观、基于流式细胞术的初筛可能性，并提示可探索“免疫评分初筛+IGRA确认”的分阶段路径；但结果属探索性，不能确立临床替代或对未治疗LTBI、治疗后致敏、活动性TB的区分能力。

关键技术方法（≤250字）：采用两阶段研究设计：第一阶段2022年1月至2023年9月在中国人民解放军联勤保障部队第九〇八医院（No. 908th Hospital of Chinese PLA Joint Logistic Support Force）纳入110例（92名男性、18名女性）作模型开发；第二阶段2023年10月至2024年6月在同一医院及江西总队医院（Jiangxi Corps Hospital）三个单位纳入159名男性作独立概念验证。用流式细胞术测定CD45⁺CD3⁺、CD45⁺CD64⁺和CD161⁺细胞百分比；构建TensorFlow Keras神经网络，系统比较12种神经元数和dropout配置，并以logistic回归和支持向量机（support vector machine, SVM）为基线。以TST和IGRA（结核特异性IFN-γ酶联免疫斑点法）为对照/参考；采用AUC、DeLong检验、IDI、校准、决策曲线和亚组交互分析。

第一阶段：使用治疗后TB组的探索性模型开发。该阶段纳入110例，比较IGRA阳性治疗后TB组与IGRA阴性健康对照。通过流式细胞术，IGRA阳性者CD45⁺CD3⁺淋巴细胞百分比高于对照，CD45⁺CD64⁺单核细胞和CD161⁺细胞百分比低于对照（均P < 0.05），支持三参数入模。通过12种神经网络配置比较，训练AUC均>0.95；Model 1（8个神经元、dropout 0.5、概率截断0.65）在留出测试集中敏感性100%、特异性92%，因敏感性最高、特异性较高且结构最简单被选为最优模型。作者提示测试集较小，估计需谨慎。

第二阶段：在独立IGRA特征队列中的探索性评价。159名男性中IGRA阳性11例、阴性148例，三个单位阳性率1.8%–12.2%。通过流式比较，IGRA阳性者CD3⁺百分比更高、CD64⁺百分比更低，而CD161⁺单独无显著差异，提示判别力来自多标志物整合；免疫评分在IGRA阳性者更高。通过事后Youden截断60.57，免疫评分敏感性81.8%、特异性80.4%、准确率80.5%、AUC 0.833；阳性预测值（positive predictive value, PPV）23.7%、阴性预测值（negative predictive value, NPV）98.4%、阳性似然比（likelihood ratio, LR）4.18、阴性LR 0.23。作者强调截断值在同队列选择，性能可能乐观，仅作探索性评价。

与TST比较。通过同一队列平行检测，TST≥5 mm敏感性90.9%、特异性72.3%、AUC 0.816；CD161免疫评分特异性高于TST（P = 0.049），敏感性差异无统计学意义（P = 0.521），DeLong检验AUC差异无统计学意义（P = 0.701），总体诊断准确性相当。不一致病例分析显示双阳2例、仅CD161阳性1例、仅TST阳性2例、双阴154例；IGRA阴性者中CD161假阳性29例、TST假阳性41例。决策曲线分析显示10%阈值下CD161净获益0.0361、TST 0.0339，CD161在更宽阈值范围维持正净获益。

高级性能指标。通过IDI分析，CD161对IGRA阳性者平均预测概率0.642、阴性者0.182，IDI为0.077（95% CI 0.012–0.142，P = 0.021），提示连续风险预测较TST二分类有改善。通过Hosmer-Lemeshow检验和校准分析，χ2 = 6.84（df = 8，P = 0.553），校准斜率1.00、截距?0.01，预测概率与观察频率一致。

亚组分析。按年龄和学校单位分层，<23岁AUC 0.782、≥23岁AUC 0.826（交互P = 0.688）；单位1（1.8%）AUC 0.797、单位2（12.2%）AUC 0.898、单位3（7.9%）AUC 0.810（交互P = 0.462）。尽管LTBI患病率存在七倍差异，点估计大体相似，但各单位IGRA阳性仅1–5例，亚组仅作描述。

操作优势。通过流程观察，免疫评分样本至结果3–4 h、可同日完成，TST需48–72 h并复诊；流式提供客观定量、自动化分析，减少TST读数的观察者间变异；作者指出免疫评分不依赖皮肤迟发型超敏反应，理论上可能较少受BCG影响，但本研究未直接评估BCG接种状态与结果关系。

性别校正和仅男性敏感性分析。因第一阶段性别分布差异显著，通过多变量logistic回归（CD3、CD64、CD161、年龄、性别）得AUC 0.88，性别校正后OR = 1.12（95% CI 0.45–2.78，P = 0.81）；仅用92名男性行敏感性分析，AUC 0.87、敏感性86%、特异性91%，提示模型性能总体稳定。

讨论部分总结。作者将本研究定位为两阶段概念验证：第一阶段基于治疗后TB免疫表型开发模型，第二阶段在独立全男性队列中以IGRA为参考作探索性评价。作者认为深度学习较logistic回归和SVM仅适度提高AUC，简单模型在资源有限环境可能足够；CD161单独判别力有限（验证队列P = 0.35；logistic单用AUC约0.68），与CD3、CD64整合后AUC可至约0.88，支持多参数而非单一标志物。免疫评分与TST总体相当、特异性较高、NPV高，IDI显著且校准良好；在三个学校中尽管LTBI患病率七倍差异，性能点估计较一致。操作上，3–4 h出结果、同日初筛、客观定量是潜在优势，但需静脉采血、24 h内处理、流式设备和培训人员，且BCG影响、成本效益、工作流程未直接评估。讨论强调不能将第一阶段治疗后TB等同于未治疗LTBI，也不能据此排除或诊断活动性TB；第二阶段仅11例IGRA阳性、全男性，截断值同队列优化，属探索性，非确定性外部验证。未来需在更大、更多样化外部队列（尤其女性）以及包含未治疗LTBI、活动性TB、治疗后TB和未感染对照的前瞻性框架中验证，并开展卫生经济学和工作流程评价。

研究结论部分翻译：研究人员开发了基于流式细胞术的免疫评分，使用混合性别第一阶段队列（治疗后TB参与者和健康对照），并在以IGRA状态为特征的独立全男性第二阶段队列中获得探索性性能估计。观察到的性能需在更大、更多样化外部队列中确认，尤其是女性。潜在操作优势包括同日实验室结果和客观测量，但既往BCG接种的影响仍未确定。这些发现支持进一步研究多参数免疫评分作为潜在的一线实验室筛查方法，但未确立其替代当前诊断路径。概念性两阶段策略（初始流式细胞术筛查后确认性IGRA）需要前瞻性外部验证、工作流程评估和卫生经济学评价。此外，在考虑临床实施前，需在明确定义的未治疗LTBI队列中进行前瞻性验证，并包括活动性TB和治疗后TB对照。