临床临界苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌的谱系相关基因组特征与表型异质性研究

《Microbiology Spectrum》：Lineage-associated genomic features and phenotypic heterogeneity in clinical borderline oxacillin-resistant Staphylococcus aureus

　　

临界苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌（Borderline oxacillin-resistant Staphylococcus aureus, BORSA）是一种缺乏mecA/mecC基因、但对苯唑西林最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations, MICs）介于1–8 mg/L的表型。其耐药的分子基础，尤其是与谱系相关的诱导谱差异，尚未完全阐明。本研究从374株临床金黄色葡萄球菌分离株中鉴定出11株来自肺炎和血流感染的BORSA临床分离株。研究人员利用表型分析、全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）、blaZ表达的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）以及时间-杀菌曲线实验，探究了耐药相关特征。所有BORSA分离株均对头孢西丁敏感、β-内酰胺酶阳性，分布于六种克隆背景中，其中ST25和ST7各包含三株分离株。WGS在所有分离株中鉴定出一个共同的GdpP N105D替换，同时伴随pbp1和pbp4中的谱系相关变异。在苯唑西林暴露后，三个ST25分离株的blaZ均显著上调（所有P < 0.001），并伴有加速的硝基头孢烯水解，而其余分离株表现出较弱或更异质性的应答。尽管苯唑西林单药治疗（1× MIC）未能阻止细菌再生长，但苯唑西林/舒巴坦联合用药产生了持续的协同杀菌效果。这一效应在ST25分离株中最为一致，而ST7分离株则显示出更大的表型变异。这些发现表明，本队列中的BORSA表型可能涉及多因素耐药谱，包括候选gdpP变异、可诱导的β-内酰胺酶活性以及青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins, PBPs）的改变。这些分离株对头孢西丁的敏感性构成了诊断挑战，可能导致治疗错误分类及随后的不适当治疗。β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合展现出有前景的体外活性，值得对表现出强可诱导β-内酰胺酶活性的BORSA分离株进行进一步研究。

研究背景与目的

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是导致医疗和社区获得性感染的主要病原体，其耐药性问题日益严峻，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus, MRSA）的全球流行已成为公共卫生危机。经典的MRSA耐药由mecA基因介导，该基因编码低亲和力青霉素结合蛋白2a（penicillin-binding protein 2a, PBP2a）。然而，一种名为临界苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌（borderline oxacillin-resistant S. aureus, BORSA）的特殊表型对现有诊断范式提出了挑战。BORSA分离株缺乏mecA和mecC基因，但对苯唑西林的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）处于1–8 mg/L的临界范围。由于常规诊断方法主要针对mec介导的耐药性，这些对头孢西丁敏感的BORSA分离株常被误报为完全敏感，导致患者可能接受疗效不佳的β-内酰胺单药治疗，尤其是在高细菌载量或快速酶水解的情况下，存在治疗失败风险。

BORSA的耐药机制是多因素的，主要包括β-内酰胺酶过度产生、编码天然青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins, PBPs）基因的突变或差异表达，以及调控基因如gdpP的变异。尽管已有描述，但克隆背景对主导耐药表型的影响尚不清楚。BORSA分离株已在多种谱系中被发现，但遗传谱系与其特定耐药机制之间的一致性关联尚未建立。因此，本研究旨在鉴定临床金黄色葡萄球菌队列中BORSA的流行情况，并整合表型分析和全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）来表征不同克隆背景下BORSA的基因组结构和突变谱，探索β-内酰胺酶诱导差异与谱系的关联，并评估β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合疗法的潜在价值。

主要技术方法

研究人员从2012年至2023年间上海14家医院收集的374株临床金黄色葡萄球菌分离株中，筛选出36株苯唑西林MIC为1–8 mg/L的候选BORSA。通过常规聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测mecA基因，并结合WGS确认mecC基因缺失，最终确定11株BORSA。采用琼脂稀释法测定MIC，头孢西丁纸片扩散法确认甲氧西林敏感性，硝基头孢烯纸片法评估β-内酰胺酶活性。利用WGS进行多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）和核心基因组MLST（core-genome MLST, cgMLST）以确定克隆谱系，并分析耐药相关基因的氨基酸替换。通过逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）检测苯唑西林暴露前后blaZ等基因的表达变化。最后，选取代表性分离株进行24小时时间-杀菌曲线实验，评估苯唑西林/舒巴坦联合用药的体外活性。

研究结果

临床BORSA分离株的鉴定与克隆多样性

在374株分离株中，11株被确认为BORSA，均来源于肺炎和血流感染标本。所有11株分离株对头孢西丁敏感（抑菌圈直径≥28 mm），β-内酰胺酶阳性，并分布在六种克隆背景中，其中ST25（n=3）和ST7（n=3）最为常见。青霉素和氨苄西林的MIC值范围广泛（0.5–64 mg/L），反映了显著的异质性。加入舒巴坦后，氨苄西林MIC的降低倍数在不同谱系间差异巨大，ST25分离株表现出最大的降低幅度（4至32倍），而其他谱系变化较小。硝基头孢烯试验显示，ST25分离株在5分钟内即出现快速且强烈的颜色变化，而ST7分离株反应强度中等，其他分离株反应延迟或更异质，表明β-内酰胺酶活性与遗传背景相关。

PBP及耐药相关调控位点的谱系相关变异

WGS分析揭示了pbp1、pbp4、yjbH和gdpP基因中的非同义替换，且其分布具有明显的谱系特异性。PBP4表现出最大的氨基酸多样性，其中E398A替换存在于10株分离株中，而其他替换如ST7和ST1281共有的T101R、T25A和C12F则呈谱系依赖性分布。PBP1的替换也因克隆背景而异，例如D149E仅见于所有三株ST25分离株。值得注意的是，环二腺苷酸磷酸二酯酶GdpP的N105D替换在所有11株BORSA分离株中均被鉴定出来，是一个共享的遗传特征。相比之下，硫氧还蛋白样调节因子YjbH高度保守，仅在一株ST22分离株中检测到S141N替换。

ST25 BORSA分离株中β-内酰胺酶操纵子的苯唑西林诱导转录谱

RT-qPCR分析聚焦于表型最强的ST25分离株。在非诱导条件下，ST25分离株的blaI转录水平比参考菌株ATCC 29213高出至少64倍，但blaZ水平接近。然而，在2 mg/L苯唑西林暴露20分钟后，所有三株ST25分离株的blaZ转录水平均显著高于诱导后的ATCC 29213（平均log₂差异约5.0–5.5，所有调整后P < 0.0001）。在菌株自身比较中，苯唑西林诱导使ST25分离株的blaZ表达上调约30至56倍（log₂变化约4.9–5.8，P < 0.001至P < 0.0001），而ATCC 29213无显著变化。对其他非ST25 BORSA分离株的探索性分析显示，苯唑西林诱导的转录响应在幅度和方向上均存在异质性，未发现统一的模式。

苯唑西林/舒巴坦对选定BORSA分离株的体外时间-杀菌活性

对三株ST25和两株ST7分离株进行的24小时时间-杀菌实验显示，苯唑西林单药治疗（1× MIC）在所有五株分离株中均导致初始菌量减少后，在8小时后出现再生长。相比之下，苯唑西林/舒巴坦联合用药产生了更持久的杀菌效果。对于三株ST25分离株，联合用药在24小时内抑制了再生长，并达到了杀菌活性（与初始接种量相比，≥3-log₁₀ CFU/mL的减少）。两株ST7分离株的反应则不一致，其中一株（ATM0077）表现出持续抑制，而另一株（S1-1-33）在8小时后出现再生长。这表明在测试条件下，苯唑西林/舒巴坦对ST25分离株的活性比对ST7分离株更为一致。

讨论与结论

本研究从374株临床金黄色葡萄球菌中鉴定出11株BORSA，它们均为mecA/mecC阴性、头孢西丁敏感且β-内酰胺酶阳性。这种表型对常规实验室诊断构成挑战，因为头孢西丁敏感性会掩盖临界水平的苯唑西林耐药性，可能导致侵袭性感染的治疗不当。研究中观察到的最一致的谱系相关模式出现在ST25分离株中，它们表现出快速的硝基头孢烯水解和增强的blaZ转录，表明其具有更强的β-内酰胺酶相关应答。由于这些ST25菌株在cgMLST、spa基因型、医院来源和标本类型上并非紧密相关，这提示该增强的β-内酰胺酶表型是该谱系的共享特征，而非单一近期传播事件。RT-qPCR结果显示，ST25分离株中blaZ的诱导增加远大于blaI和blaR1的变化，鉴于这三个基因作为多顺反子单元转录，这种不平衡可能反映了转录后调控，如转录稳定性的差异。

基因组学发现支持BORSA的多因素耐药模型。所有分离株共享GdpP N105D替换，但其功能影响需通过等位基因置换或互补实验验证。PBP的替换可能仅是稳定的谱系相关多态性，但ST25中pbp1的D149E替换此前也在其他BORSA ST25分离株中被报道。时间-杀菌实验进一步证实了这一点：苯唑西林/舒巴坦在ST25分离株中产生最持久的杀菌效果，这与它们快速的水解活性和增强的blaZ转录一致，表明可被抑制剂抑制的β-内酰胺酶活性对其联合用药反应有贡献。而在非ST25分离株中，联合用药的效果一致性较差，说明其活性可能取决于潜在的耐药谱，而非单纯的BORSA标签。

研究结论指出，本研究数据支持BORSA的多因素耐药模型，其中可诱导的β-内酰胺酶活性、PBP变异以及更广泛的调控特征与本队列中的表型异质性相关。ST25分离株表现出更显著的blaZ诱导反应和更一致的体外β-内酰胺酶抑制活性，而其他遗传背景则显示出更大的表型变异性。这种异质性可能导致诊断挑战和对β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的差异性反应，强调了在更大规模队列和临床研究中进一步验证的必要性。