裂解性铜绿假单胞菌噬菌体BUCT980的生物学特征及其在小鼠肺部感染模型中的治疗效果评价

《Microbiology Spectrum》：Biological characterization of the lytic Pseudomonas aeruginosa phage BUCT980 and its therapeutic efficacy in a murine lung infection model

　　

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的机会性病原体，其日益严重的多重耐药性限制了传统抗菌治疗方案的选择，凸显了替代性抗菌策略的必要性。本研究分离并系统鉴定了一株新型裂解性噬菌体BUCT980，并评估了其抗菌活性及治疗潜力。透射电子显微镜（TEM）显示BUCT980为肌尾噬菌体（myovirus）。一步生长曲线分析表明，其表观潜伏期约为60分钟，裂解量约为每个感染细胞173个噬菌斑形成单位（PFU）。BUCT980基因组长度为60,697 bp，比较基因组学和系统发育分析支持其归属于尾噬菌体纲（Caudoviricetes）。基因组分析未鉴定到已知的溶原相关基因、毒力因子或抗生素抗性基因。体外实验表明，BUCT980在测试的各感染复数（MOI）下均显著抑制铜绿假单胞菌PAO1的生长，并抑制生物被膜形成。在10倍系列稀释点滴试验中，BUCT980在29株临床分离株中的4株上形成清晰噬菌斑，并在另外13株代表多种序列型（ST）的分离株上产生可见的抑制效应。在急性铜绿假单胞菌肺炎小鼠模型中，鼻内给予BUCT980显著提高存活率、降低肺部细菌载量并减轻肺损伤。短期观察期间，肝和肾未出现明显的组织病理学异常。这些发现支持进一步评估BUCT980作为急性铜绿假单胞菌肺部感染候选治疗噬菌体的价值。

论文解读

一、研究背景与研究意义

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的机会性病原体，可引起呼吸道感染、脓毒症及其他侵袭性感染，尤其常见于危重症患者和烧伤患者。其突出的环境适应能力以及内在性和获得性抗菌药物耐药性，导致持续性感染并使临床治疗日益困难。抗生素的广泛使用进一步加速了对β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等多类抗菌药物耐药性的出现，逐步限制了传统治疗方案的选择。多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）铜绿假单胞菌感染因此与反复感染、治疗选择有限及不良临床结局相关。在这一背景下，噬菌体疗法因其能够选择性感染并裂解敏感铜绿假单胞菌菌株，重新成为有前景的替代或辅助性抗菌策略。然而，不同临床铜绿假单胞菌分离株对噬菌体的敏感性差异显著，这是治疗应用的重要限制因素。因此，建立多样化且特征明确的噬菌体库，对于提高针对个体临床分离株筛选活性噬菌体的可能性、支持噬菌体筛选及鸡尾酒疗法开发至关重要。本研究旨在分离并系统鉴定一株新型裂解性铜绿假单胞菌噬菌体BUCT980，评估其基因组特征、生物学特性、体外抗菌活性以及在急性肺炎小鼠模型中的治疗功效，以扩充针对铜绿假单胞菌的可用噬菌体资源，并支持其进一步的临床前评估。

二、主要技术方法

研究人员从医院污水中以铜绿假单胞菌PAO1为宿主菌分离获得噬菌体BUCT980，经三轮纯化获得均一噬菌体群体。采用透射电子显微镜（TEM）观察病毒粒子形态；通过一步生长曲线、吸附动力学、最适感染复数（MOI）测定、热稳定性和pH稳定性实验进行生物学表征。利用Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组测序，通过RAST服务器预测开放阅读框（ORF），使用BLASTp进行功能注释，采用ViPTree构建系统发育树，并使用JSpeciesWS计算平均核苷酸一致性（ANIm）。宿主范围通过10倍系列稀释点滴试验对30株铜绿假单胞菌菌株（包括参考菌株PAO1和29株临床分离株）进行评估。体外抗菌活性通过生长曲线法和结晶紫染色生物被膜试验评估。动物实验采用C57BL/6N小鼠建立急性铜绿假单胞菌肺炎模型，通过鼻内途径给予噬菌体治疗，评估存活率、肺部细菌载量、组织病理学改变及血浆中和活性。

三、主要研究结果

噬菌体分离及其形态学特征。 研究人员从医院污水样品中分离获得噬菌体BUCT980，在双层琼脂平板上形成清晰、圆形、边界明确且中心透明的噬菌斑。TEM显示BUCT980为肌尾噬菌体，由直径63.13 ± 0.83 nm的头部和长112.55 ± 0.48 nm的尾部组成。

噬菌体BUCT980的宿主范围。 宿主范围分析针对30株铜绿假单胞菌菌株进行。BUCT980对PAO1（ST549）、pae02（ST2960）、pae07（ST3491）、pae18（ST244）和pae27（ST316）表现出裂解活性，半定量点滴试验评分分别为8、4、7、9和6。另有13株临床分离株显示可见的生长抑制但无重复性清晰噬菌斑形成。其余12株临床分离株在测试条件下未观察到可检测的抑制或噬菌斑形成。

基因组特征与系统发育分析。 BUCT980全基因组为60,697 bp的双链DNA分子，G+C含量为64.48%，GenBank登录号为PZ316258。基因组注释预测共85个ORF，其中38个被赋予推定生物学功能，其余注释为功能未知的假定蛋白。这些ORF分为五大功能模块：噬菌体结构组成（18个ORF）、DNA复制与修复（12个ORF）、转录与翻译（3个ORF）、噬菌体包装（3个ORF）和宿主裂解（2个ORF）。未鉴定到已知的溶原相关基因、毒力因子或抗生素抗性基因。BLASTn分析显示BUCT980与铜绿假单胞菌噬菌体Lydia（PV031332.1）具有最高基因组相似性（97%）。比较基因组学分析显示其与Lydia、Aergia、Churro、LKO4和M6等噬菌体具有高度保守的基因组组织和共线性。全基因组系统发育分析表明BUCT980与铜绿假单胞菌噬菌体AAT-1（NC_073038）亲缘关系最近，支持其归属于尾噬菌体纲（Caudoviricetes）中的Mesyanzhinovviridae科。

噬菌体BUCT980的生物学特征。 最适MOI测定显示，在MOI为0.01时获得最高终点噬菌体滴度，约为8.7 × 10¹⁰ PFU/mL，显著高于其他组（P < 0.05）。吸附动力学表明，感染后15分钟约67%的噬菌体吸附至宿主细菌。一步生长曲线显示表观潜伏期约为60分钟，随后进入爆发期，噬菌体滴度从约3 × 10⁴ PFU/mL迅速上升至1 × 10⁹ PFU/mL，最终在约360分钟达到约3 × 10¹⁰ PFU/mL的平台期，裂解量约为173 PFU/细胞。热稳定性实验表明BUCT980在4–37°C范围内保持感染活性，45°C时滴度下降至约2.67 × 10⁹ PFU/mL，55°C时降至0.8 × 10⁸ PFU/mL，65°C和75°C时无可检测活性。pH稳定性实验显示BUCT980在中性至弱碱性条件下保持相对稳定，pH 8时滴度最高（约1.42 × 10⁹ PFU/mL），pH 4时显著下降至3.33 × 10⁵ PFU/mL，pH 3和pH 12–13时无可检测活性。

噬菌体BUCT980对铜绿假单胞菌的体外抗菌效果。 在所有测试MOI下，BUCT980在孵育早期均显著抑制PAO1的生长。MOI为0.01时抑制效果最强，孵育结束时OD₆₀₀值比单独细菌组低约0.9。然而，所有噬菌体处理组在约10小时后均出现明显的细菌再生长，这可能与低敏感性细菌亚群的选择或富集有关。生物被膜抑制试验表明，BUCT980在所有测试MOI下均有效抑制生物被膜形成，MOI为100时抑制效果最强（OD₅₉₅从约0.052降至约0.017）。但预形成生物被膜试验显示，BUCT980在任何测试MOI下均未显著减少成熟生物被膜的生物量。

噬菌体BUCT980在鼠急性肺炎模型中的治疗效果。 研究人员建立了鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型，不同细菌接种量显示剂量依赖性死亡率。1 × 10⁸ CFU感染剂量在72小时时约50%存活率，被选为后续治疗实验的中等致死感染剂量。感染后1小时鼻内给予噬菌体治疗显著延长存活时间，约60%存活率维持至144小时。噬菌体治疗显著降低肺部细菌载量，从5.27 × 10⁴ CFU/mL降至2 × 10³ CFU/mL，效果略弱于环丙沙星治疗组（0.18 × 10³ CFU/mL）。血浆中和活性检测显示，噬菌体与各组血浆共孵育后滴度仍保持在1 × 10⁸ PFU/mL以上，组间无显著差异，表明鼻内给药24小时后未检测到针对BUCT980的血浆中和活性。组织病理学分析显示，感染组小鼠肺组织出现严重病理损伤，表现为广泛炎性细胞浸润、肺泡壁增厚、出血及肺泡结构破坏；噬菌体治疗组这些病理改变显著减轻，炎性浸润减少且肺泡结构部分保留。肝和肾在实验期间未观察到明显的治疗相关组织病理学异常。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，BUCT980的基因组呈典型模块化组织，未检测到已知的溶原相关基因、毒力因子或抗生素抗性基因，支持其进一步治疗评估。约60分钟的潜伏期和约173 PFU/细胞的裂解量处于其他铜绿假单胞菌噬菌体的报道范围内。体外实验中约10小时后出现的细菌再生长提示单一噬菌体长期暴露无法维持持续的细菌抑制，噬菌体鸡尾酒疗法可能有助于降低单一耐药机制影响治疗的风险。BUCT980对生物被膜形成的显著抑制提示其在生物被膜发育早期干预中具有优势，但对成熟生物被膜活性有限，联合抗生素、互补噬菌体或基质降解酶可能改善其活性。宿主范围分析显示菌株水平敏感性差异显著，同一ST的分离株可表现出不同反应，表明ST反映细菌遗传背景但不能单独预测噬菌体敏感性。BUCT980对来自多种ST背景的临床分离株具有活性，这些ST已在呼吸机相关性肺炎、慢性支气管炎广泛耐药菌株及烧伤患者血流和伤口感染等临床相关感染中被报道。在急性肺炎小鼠模型中，鼻内给药显著改善存活率、降低肺部细菌载量并减轻组织病理损伤，表明BUCT980经呼吸道给药后保持活性。

研究结论认为，BUCT980是一株裂解性铜绿假单胞菌噬菌体，对PAO1及部分遗传多样的临床分离株具有活性，体外可抑制浮游生长和生物被膜形成，在急性肺炎小鼠模型中可降低肺部细菌载量和肺损伤。基因组筛选未鉴定到已知的溶原相关基因、毒力因子或抗生素抗性基因。这些发现支持BUCT980的进一步临床前开发，但其在更广泛临床分离株中的活性、耐药谱、对临床分离株的功效及长期安全性仍需进一步评估。